半固相生化反应试剂板的研制*

高德禄 张世俊 牛 刚 张金树

随着生物技术的进步，医学诊断必然向着更方便、更灵敏、更准确的方向迈进。而实验技术仪器的小型化、操作简单化、结果报告即时化的新检验模式越来越受到人们的青睐，并适应当今社会发展高效快节奏的工作方式，满足人们在时间上的要求，可使患者尽早得到诊断治疗。

半固相化学反应技术是指将某检测项目所需的多种试剂分别固定于载体板上，当微量液态样品加到载体板上后，通过低速离心准确将样品渗滤分别与各室试剂发生反应并产生颜色，最后通过检测颜色的程度计算出样品中检测项目的含量。通过研究拟将载体板改为双层透明的胶板，并设计同板对照区，使比色反应符合郎白-比尔定律，结果更为准确可靠，操作更为简单便捷。

可检测项目主要为钾、钠、血糖、尿素、肌酐等。现将半固相生化反应试剂板的研制介绍如下∶

1 方法

1.1 试剂成分的研发

首先参考我国卫生部医政司颁布的全国临床检验操作规程第三版，并对进口干式生化仪的部分检测项目(血钾、钠、二氧化碳、葡萄糖、尿素氮、转氨酶)进行方法学摸索，确定反应方法、反应时间和波长等参数。以上检测项目均采用酶法，试剂成分及浓度均进行大量实验摸索以达到优化。

1.2 半固相反应板模型的建立

通过对半固相载体的材料成分研究，获取渗透性好且不参与整体反应的凝胶物质，分区铺入载体板，同时检测卡标识有密码磁带，与信息系统配合，将反应所需的全部资料通过读码器输送给检测仪的微机，包括项目名称、范围、方法、反应时间、波长选择等；载体板分为试剂载体区和透明比色区，使比色反应符合郎白-比尔定律，结果更为准确可靠。后期将设计CD盘式样的检测仪和微机操控低速离心来达到样品与各个反应室反应，提高固相化学反应的准确性和重复性。

1.3 半固相反应板性能测试

研发出多项微量生化检测卡，多个项目可集成为圆形单体也可自行组合。收集健康查体人群的新鲜血液标本50份，取微量全血滴于试剂板上的标本孔，血细胞等杂质被滤膜阻隔，置于检测仪；血清经一定时间离心与固相试剂一步或两步溶解反应显色，在特定波长下进行检测分析。同时血液标本经3000 rpm/min离心5 min后，于生化自动分析仪BECKMAN C800上进行相同项目的检测，试剂均为BECKMAN原装试剂，检测结果进行相关性比较。

2 结果

2.1 确定检测项目各种参数

各检测项目参数分别为∶①血钾，酶法，两点速率法，波长为340 nm。试剂Ⅰ主要含有磷酸烯醇丙酮酸、ADP、NADH、丙酮酸激酶等。试剂Ⅱ主要含有LDH；②血钠，酶法，两点速率法，波长为405 nm。试剂I主要含有β-D-半乳糖苷酶等。试剂Ⅱ主要含有邻硝基酚-β-D-半乳糖苷酶；③二氧化碳，酶法，两点速率法，波长为340 nm。试剂主要含有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸、苹果酸脱氢酶、NADH等；④葡萄糖、己糖激酶法，速率法，波长为340 nm，试剂主要含有己糖激酶、葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸、NADP等；⑤尿素氮，酶偶联速率法，波长为340 nm，试剂主要含有尿素酶、α-酮戊二酸、NADH等；⑥丙氨酸氨基转移酶，速率法，波长为340 nm，试剂主要含有丙氨酸、α-酮戊二酸、NADH等；⑦天门冬氨酸氨基转移酶，速率法，波长为340 nm，试剂主要含有天门冬氨酸、α-酮戊二酸、NADH等。

优化反应成分的原则是试剂成分宜在干燥密闭状态下长期保存，经血液标本润湿后能够迅速溶解，且在短时间内(5 min)可反应显色或显浊度，达到检测时间短、结果准确的目的。研制中采用多层隔膜技术将试剂固化分隔，保障有效参与反应且可排除标本中的有色干扰物质，大量标本测试并与自动化分析检测结果比较，最终确定反应成分的各种浓度。

2.2 半固相反应板模型的独到优势

半固相反应板模型技术有独到的优势。①采用离心式快速半固体生化检测，标本不需预处理，血浆通过辅助层消除干扰物在经过转移层到反应区，有效降低基质效应对测定结果的影响；②采用酶工程技术使得固定化的酶具有“分子识别”的功能而清除干扰物质；③除试剂卡外无其他任何废液、废物，且其便携式的仪器性能优异而又小巧玲珑；④检测卡大小为1 cm×3 cm，易于保存，稳定性好，室温下存贮于小筒内，可作单一参数分析，也可进行多参数联合检测；⑤检测卡条码化，微机系统自动根据磁带上提供的参数控制反应时间和光学检测；⑥配备自检条监测仪器和检测卡的状态；⑦工作条件易满足，只需一般干电池即可；⑧无需其他配套仪器，节省检验空间，为快速检验提供了极大的可能与方便。

2.3 半固相反应板性能评价

收集健康查体人群的血液标本50份，取微量全血分别滴于试剂板上的标本孔，在一定时间内、特定波长下进行检测分析。同时血液标本经3000 rpm/min离心5 min获得血清，血清于生化自动分析仪及免疫自动分析仪进行相同项目的检测并进行相关性比较(见表1)。

表1 项目测试结果比较(n=50)

3 结论

POCT也称即时检验，由于分析方法简单、快速、正确，同时因为是现场分析，极大减少了样品转送流程，既缩短了报告时间，也降低了发生差错的机会，实现了个性化的服务。反应原理主要包括∶干化学测定、免疫测定、生物传感器技术、生物芯片技术，也可多技术综合应用[1-3]。

干化学测定包括尿液分析试条和血液干化学分析，已在临床检验中普遍采用。尿液分析增至10多项。血液干化学测定仪可测胆固醇、甘油三脂、葡萄糖、ALT、AST、胆红素、肌酸激酶、尿素、肌酐、尿酸和淀粉酶等。

免疫层析试验可测感染性疾病的抗原抗体、心肌标志、肿瘤标志、激素和各种蛋白质等，适合于定性。

新一代POCT仪器使用生物传感器，利用离子选择电极，底物特异性电极，电导传感器等特定的生物检测器，是酶化学、免疫化学、电化学与计算机技术的结合。

生物芯片是最新发展的新技术，其特点是在小面积的芯片上同时测定多个项目。目前可分基因芯片、蛋白质芯片和细胞芯片，相信不久的将来芯片式的POCT仪将逐步应用到各个领域。

野战医学检验是各种灾难现场伤病员救治不可缺少的部分，但我国检验医学领域中的技术方法、检测项目等都相对滞后，因此研制高科技、低成本、体积小、重量轻能满足急救检验为主要目的且便于装备基层医疗机构，特别是偏远地区的检验设备具有很大的重要性和迫切性。研究组借用市售国外检测卡的检测原理并加以突破。考虑对检测时间的要求，多采用酶速率法，并对产品进行合理的工艺改革和优化，成功获得不同检测项目甚至多项目集成的检测卡。通过与所研发精密度好、结实耐用的检测仪器配合使用，如温控系统、光学系统、反应检测时间等参数进行调试，保证良好的重复性和准确性，在现场操作中具备小巧灵活、操作简单、快速检测、检测性能且和常规使用方法相媲美等优点。

此研究着重研制适应野外条件下工作的便携式快速检验检测卡，它集现代化学、光学、酶工程、新材料、化学计量学和计算机技术于一体，完全可以及时准确检测患者电解质（K+、Na+）、葡萄糖、尿素氮、肌酐以及转氨酶等生命的重要指标，可为伤病员在第一时间获得有效救治提供可靠依据，更好提高基层单位的医疗保障能力。经与临床常规方法比较，两者相关性良好，完全符合急救需要，并与其他报道结果相近[4-5]。

半固相生化检测卡和检测仪的工作条件易满足，只需一般干电池即可；无需其他配套仪器，节省检验空间。由于其准确度、精密度高，可测定少量检品，不需配制试剂，操作简便快速，无需过多培训，检测可随时随地进行，尤其适合野外野战条件下卫生所一级急救、前线医院和一些特殊条件下的使用，为野战环境下快速检验提供了极大的可能与方便，充分展示其独到优势。

[1]张亚楠，张国军，吕虹，等.POCT临床应用进展[J].中国医疗器械信息，2010，16(12)∶14-16.

[2]彭燕，胡娟.POCT发展现状及临床应用[J].西南国防医药，2009，19(2)∶259-260.

[3]董作亮.POCT的研究进展[J].国外医学临床生物化学与检验学分册，2003，24(3)∶164-166.

[4]程丽萍.干与湿化学法检测部分生化项目的分析比较[J].检验医学与临床，2010，7(12)∶1245-1246.

[5]邵建伟.湿化学、电极法、干化学法检测K+、Na+、Cl-结果比较[J].淮海医药，2007，25(3)∶209-210.