益气补肾中药对自然流产模型小鼠CD28分子表达的影响

陈雪君 浙江省台州医院 台州 317000

叶 平 浙江省中医院

胡蓝雅文 黄丹云 丁键红 浙江中医药大学

益气补肾中药对自然流产模型小鼠CD28分子表达的影响

陈雪君 浙江省台州医院 台州 317000

叶 平 浙江省中医院

胡蓝雅文 黄丹云 丁键红 浙江中医药大学

目的：观察益气补肾中药对小鼠母胎免疫的调节作用。方法：以CBA雌鼠×DBA/2雄鼠建立小鼠自然流产模型，将20只CBA孕鼠随机分成四组，每组5只。空白对照组（NS组）予生理盐水灌胃，西药组予环孢菌素A（CsA）灌胃，中药组予益气补肾中药灌胃，中西结合组予中药+CsA灌胃。妊娠14天处死孕鼠，取脾脏与母胎界面组织，用流式细胞分析术（FCM）分析各组孕鼠CD28分子的表达情况。结果：CD28分子在脾脏表达趋势从高到低依次为：生理盐水组、西药组、中西结合组、中药组，各治疗组CD28分子表达均低于NS组（P＜0.05）；CD28分子在母胎界面上表达趋势从高到低依次为：生理盐水组、中药组、西药组、中西结合组，中西结合组CD28分子表达低于NS组、西药组和中药组（P＜0.05）；中药组、西药组CD28分子表达均低于NS组（P＜0.05）。结论：益气补肾中药对自然流产模型小鼠有下调CD28分子表达的作用趋势。

小鼠 自然流产模型 CD28 益气补肾 中药

近年来，我们临床选取补中益气汤加减治疗反复自然流产（SA），取得满意疗效。关于其在母胎免疫中是否具有调节CD28分子表达的作用，目前国内尚未见报道。本研究观察益气补肾中药应用于小鼠自然流产模型小鼠CD28分子的表达影响，探讨益气补肾中药对母胎免疫调节的作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 8～10周龄、性成熟、体重20g左右的雌性CBA小鼠40只，雄性DBA/2小鼠20只。由浙江中医大学动物实验中心提供，动物使用许可证号：SCXK（沪）2008-0016。实验小鼠饲养在浙江中医大学动物实验中心清洁级动物房内，环境温度：（25±1）℃，相对湿度50%～70%，换风次数15～20次/h，光照150～200Lx，12h明暗交替，噪音＜50dB,自由摄食与饮水。实验前，先不加任何干预，将小鼠饲养1周，使其很好地适应环境。

1.2 药 品 益气补肾中药煎剂：黄芪36g，党参12g，当归6g，陈皮、升麻、柴胡各12g，白术18g，菟丝子30g，加水浓煎至每毫升汤剂含2g生药。中药饮片购自浙江省中医院中药房，浙江中医药大学中药实验室煎制。密封保存于消毒容器中，置于4℃冰箱内保存备用。

1.3 主要试剂 生理盐水、环孢菌素A（新山地明，CsA）购自浙江省中医院中药房。磷酸盐缓冲液(PBS溶液)、RPMI-1640培养液（吉诺生物医药技术有限公司生产）；小鼠淋巴细胞分离液(天津TBD灏洋生物制品科技有限责任公司生产)；FITC Conjugated Anti-mouse CD3e、PE Conjugated Anti-mouse CD28、PE ConjugatedAnti-mouseCD152（CTLA-4）、PE Conjugated Armenian Hamster IgG Isotype Control、PE Conjugated Golden Syrian Hamster IgG Isotype Control（均由美国eBioscience公司生产）。

1.4 主要设备与仪器 微量移液枪（0.1-5000μL，德国 Eppendorf公司）；低速自动平衡离心机（LDZ5-2型，北京京立离心机有限公司）；漩涡混合器（XW-80A型，上海医科大学仪器厂）；血球计数板（XB-K-25型，上海求精生化试剂仪器有限公司）；光学显微镜（CX31RTSF型，日本OLYMPUS公司）；流式细胞仪（Facs Calibur基本型，美国BD公司）。

2 实验方法

2.1 模型制备 将20只雌性CBA小鼠编号、称重，根据随机数字表随机分为生理盐水对照组（NS组）、西药组、中药组、中西结合组，每组各5只。与雄性DBA/2小鼠以2：1合笼交配，造自然流产模型。合笼后，每天观察雌鼠阴栓，见阴栓日为妊娠第0天。

2.2 给药途径与剂量 NS组自妊娠第0天开始，予生理盐水10ml/kg灌胃，1天1次。西药组：妊娠第4天（着床期）予环孢菌素A10mg/kg灌胃1次。中药组：自妊娠第0天开始，予益气补肾中药27g/kg灌胃，1天1次。中西结合组：自妊娠第0天开始，予益气补肾中药27g/kg灌胃，1天1次，并在妊娠第4天予环孢菌素A10mg/kg灌胃1次。

2.3 观察指标与检测方法

2.3.1 标本采集 妊娠第14天处死小鼠，75%乙醇消毒后，用眼科剪剪开小鼠腹部皮肤肌肉、腹膜，钝性分离脾脏。钝性+锐性分离子宫，用镊子撕开子宫，除去胚胎及胎盘，留下子宫及蜕膜组织，即为母胎界面组织。

2.3.2 制备脾脏单细胞悬液 将取出的脾脏用PBS溶液洗一次后，置于装有2mL RPMI-1640培养液的平皿中，用1mL注射器抽取RPMI-1640培养液冲打脾脏，至脾脏呈半透明状，过200目网筛，制成细胞悬液。用移液枪将细胞悬液加至同体积的小鼠淋巴细胞分离液上，注意保持液体分层清晰。以2000r/min的转速离心15min后，移液枪吸取云絮层，置入装有4mL RPMI-1640培养液的试管中。摇匀，再以1500r/min的转速离心10min后，弃去上清液。洗涤：加入1mL的PBS溶液，反复冲打，再以1500r/min的转速离心10min后，弃去上清液。重复洗涤2次后，再加入0.5mL PBS溶液，反复冲打，制成单细胞悬液。

2.3.3 制备母胎界面组织单细胞悬液 将取出的母胎界面组织用PBS溶液洗一次后，置于装有3mL RPMI-1640培养液的平皿中，剪碎，研磨，过300目滤网，制成细胞悬液。余步骤同脾脏单细胞悬液的制备。

2.3.4 计数细胞 将单细胞悬液添加到血球计数板上，显微镜下计数细胞，调节浓度至1×107/mL。

2.3.5 细胞染色和流式细胞分析术（FCM）分析 取4支试管，编号为：实验管（a、b）、对照管（a、b）。a试管加入100μL脾脏单细胞悬液，b试管加入100μL母胎界面组织单细胞悬液，按标准化法标记细胞，见表1。

表1 各管所加单抗与剂量

加抗后用漩涡混合器涡旋振荡，避光孵育30min后，再每管加入0.5mL PBS溶液洗涤离心一次，弃上清液，然后将细胞重悬于200μL PBS液中，即刻上机，用Cell Quest软件获取细胞,每份样本检测1× 105个细胞,结果以CD3+CD28＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比进行计算。测试完毕后用Cell Quest Pro软件分析数据。

2.4 统计学方法 实验结果用SPSS13.0统计学软件包处理分析，实验数据以（±s）表示，进行t检验；组间差异比较采用one-way ANOVA检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 一般情况 各组小鼠精神状态、活动情况、饮食、二便、毛发光泽度等情况均无殊，未见阴道口流血现象。

3.2 各组间CD28分子的表达差异 实验结果以CD3+CD28＋T细胞占CD3＋T细胞的百分比计算。妊娠14天各组CD28分子表达情况见表2。

表2 妊娠14天各组CD28分子的表达情况（ x±s ） %

4 讨 论

T辅助（Th）细胞的功能性分化是近年来免疫学研究的热点之一，Th细胞根据其分化后产生Th1/Th2两类不同的T辅助细胞1（Th1）、T辅助细胞2（Th2）细胞因子平衡与妊娠结局关系密切。Th1、Th2细胞有着不同的功能。Th1型细胞因子具有胚胎毒作用，妨碍早期胚胎的发育，引起妊娠丢失；相反Th2型细胞因子具有免疫营养作用，对正常妊娠的维持起保护作用。正常妊娠是以母体向Th2型细胞因子偏移的体液免疫应答；而病理性妊娠如不明原因的反复自然流产则以向Th1型细胞因子偏移的细胞免疫应答[1]。

T细胞的活化除了需要抗原刺激外，还需第二信号的参与。当第一信号和第二信号同时存在时，T细胞克隆活化并增殖，产生免疫应答；当仅有第一信号而缺乏第二信号时，则可诱导T细胞产生抗原特异性无反应(anergy)，被认为是造成抗原特异性免疫耐受的重要机制[2]。

第二信号的传递主要由协同刺激分子完成，CD28分子是共刺激分子B7分子的受体。CD28主要与B7-1（CD80）结合，启动T细胞活化途径。CD28与T细胞受体 (TCR)、CD3协同作用,产生双刺激信号以激活T淋巴细胞，诱导Th细胞向Th1分化[3]。

中医认为，自然流产的病因病机主要有母体冲任损伤和胎元不健两个方面。其中又以母体脾肾两虚最为关键。肾主先天，精藏于肾，而胞脉系于肾，胎元是否巩固主要责之肾精、肾气是否充实；胎孕已成后不仅需先天生殖之精的滋养和肾气的巩固，还有赖于后天水谷之精的充养。脾为后天之本，脾虚运化水谷精微不足，必致气血亏虚，胎失所养，导致胎元不固而损堕。因此，治疗上应脾肾兼顾。

本实验所用的益气补肾方为导师叶平副教授根据临床经验，结合文献资料研究，由经方化裁而来。方中重用黄芪、菟丝子，两者共为君药。黄芪味甘微温，入脾肺经，补中益气，升阳固表；菟丝子辛、甘、平，入肾、肝、脾经，具有补肾益精、养肝明目、安胎之效。党参、白术补气健脾为臣。当归养血和营，协党参、黄芪以补气养血；陈皮理气和胃，使诸药补而不滞，共为佐药。并以少量升麻、柴胡升阳举陷，协助黄芪以升提下陷之中气，为佐使药。全方以益气补肾为主，兼顾健脾养血，达安胎之效。药理研究证实[4]，益气补肾中药具有免疫调节作用，有利于母胎界面免疫耐受状态的维持，是临床保胎治疗的常用药物。

实验结果表明，益气补肾中药在妊娠14天，对于自然流产模型小鼠均有下调CD28分子在局部表达的作用（P＜0.05），有下调CD28分子在全身表达的作用趋势（P＞0.05）。推测益气补肾中药可能通过下调CD28分子表达，减少Th细胞向Th1分化，维持Th1/Th2平衡，从而有利于妊娠状态的维持，降低自然流产发生率。这在一定意义上，可为临床上益气补肾中药治疗SA提供理论依据。实验结果显示，各组间观察指标差异虽有一定的趋势，但无统计学意义（P＞0.05），有待于大样本的实验进一步研究。

［1］Wilczynski Jacek R.Immunological analogy between allograft rejection,recurrent aborti-on and pre-eclampsia the same basic mechanism［J］.Human Immunology，2006,67（7）: 492-511.

［2］Harding FA,McArthur JG,Gross JA,et al.CD28-mediated signaling costimulates murine T cells and prevents induction of anergy in T-cell clones［J］.Nature,1992, 356:607-609.

［3］金莉萍，李大金，王明雁，等.孕早期干预协同刺激信号诱导自然流产模型孕鼠外周母-胎免疫耐受［J］.中华妇产科杂志,2004（4）:234-237.

［4］武美丽，柳肃芬.反复自然流产的免疫学研究进展与展望［J］.中国妇幼保健，2007，22:1707-1708.

Effects of Traditional Chinese Medicine with function of invigorating Qi and tonifying kidney on CD28 in

Abortion-Prone Mice

CHEN Xuejun,YE Ping,HULAN Yawen,et al．Taizhou Hospital of Zhejiang,Taizhou(317000),China

Abstrct Objective:To study the effects oftraditional Chinese medicine(TCM)with function ofinvigorating Qi and tonifying kidney on the expression of CD28 at spleen and maternal-fetal interface in abortion-prone mice during pregnancy. Methods:CBA female mice were mated to DBA/2 male mice to establish an abortion-prone model.The female mice were divided randomly into 4 groups(5 in each):control group(NS group):drenched normal saline everyday since the first day of gestation;western medicine(WM)group(cyclosporine group):drenched cyclosporine solution once on the 4thday of gestation;TCM group:drenched the TCM decoction with the function of invigorating Qi and tonifying kidney everyday since the first dayofgestation;and TCM-WM(TCMdecoction+cyclosporine)group:drenched the TCMdecoction everyday since the first day and cyclosporine solution on the 4thday of gestation.On the 14thday of gestation,the mice were killed in batches and their spleen and maternal-fetal interface tissues were made into single cell suspension to detect the expression of CD28 by flow cytometry (FCM).Results:The expression of CD28 in spleen tissues in NS group,cyclosporine group,TCM-WMgroup,and TCMgroup was fromhigh tolowin order and it was significantlylower in the latter 3 groups as compared with the NS group(P＜0.05).The expression ofCD28 at maternal-fetal interface in the NS,TCM, cyclosporine,and TCM-WM group was from high to low in order,with a significant difference between the TCM-WM group and the NS,TCMand cyclosporine groups(P＜0.05)and between the TCMand WMgroups and the NS group(P＜0.05).Conclusion:TCM with function of invigorating Qi and tonifying kidney may reduce the expression of CD28 in abortion-prone mice.

mice spontaneous abortion CD28 invigoratingQi and tonifyingkidney TCM

2010-08-02