作物花粉自动采集传感器的研制与定标

邱康俊，胡汉峰，胡凝，江晓东，顾松山

(1.南京信息工程大学大气物理学院，江苏南京210044;2.安徽省气象局大气探测技术保障中心，安徽合肥230031;3.南京信息工程大学应用气象学院，江苏南京210044)

0 引言

生物技术进步推动农业科技革命和现代农业快速发展，通过基因重组，将控制优良性状基因按照人类需要转移到相应作物，进而培育出具有抗虫、耐湿、耐旱等优良性状的新品种。自1983年第一例转基因烟草成功培植，转基因作物发展迅速。目前转基因研究至少在35科200种植物中获得成功，转基因作物在全世界20多个国家种植，并且其商业栽培面积是20世纪90年代的50倍(胡平等，2006;陈兴玲等，2007)。

转基因作物带给人类巨大利益的同时，还存在着难以预知的潜在威胁(Jia，2004;胡平等，2006)。一是转基因作物本身与其野生种的生存竞争和“杂草化”;二是抗性基因转移是否会产生“超级害虫”、“超级病害”;三是对生物多样性及生态平衡的影响。自然界中，植物花粉是各种控制遗传性状基因的有效载体，即作物基因通过花粉进行转移和传播。花粉扩散主要途径是花粉逃逸，还包括动物携带扩散及昆虫采粉扩散等。随着转基因作物日益增多，转基因花粉释放逃逸面积不断扩大，导致各种转基因花粉地理分布及生长空间重叠，产生不可预知的基因危害。

为此需要研究转基因作物花粉逃逸规律(Song et al.，2004;Wang et al.，2006;Yuan et al.，2007)，考察种和种之间从花期、传粉受精、胚胎发育到结实全过程的生物特性和相互间的亲和性(宋小玲等，2005)，探明各种转基因逃逸情况，建立量化风险评估体系(钱迎倩等，1998;朱琳和佟玉洁，2003;Jia，2004;陈兴玲等，2007)。首先要了解自然环境中转基因花粉在三维空间分布及其随时间演变情况。另外基因花粉逃逸与地球近地面边界层大气内的温度、湿度、风向、风速等大气物理参数及其变化有关。在下风方向，花粉逃逸最大距离随着风速的增大而增大(Song et al.，2004)，并且单位面积花粉密度分布规律与风向风速大气稳定度等气象条件有一定关系(陈万隆和肖静芬，1995;Song et al.，2004;Hu et al.，2007;魏玉香等，2009)。建立转基因花粉逃逸安全性定量数学模型(Hu et al.，2007;杨颖，2007;Yao et al.，2008;罗蒋梅等，2009)，加入各种大气物理参数及其变化梯度。因此“实时”采集转基因花粉对研究基因花粉逃逸规律及建立量化风险评估体系有着重要意义。

1 仪器原理

1.1 工作原理

目前采集转基因花粉主要有两种方法，一是1943年Durham提出的自然重力收集法，将涂有粘合剂的载玻片，按照一定空间规律放置于转基因作物实验田中直接进行花粉采集(李仁忠等，2007;刘寿东等，2008;赵莉莉等，2009)，其原理是随风飘散的花粉在其自身重力作用下被载玻片捕获。二是基于空气流体连续性，通过一定的方法使转基因花粉随空气流过采样介质被粘合剂所捕获。20世纪50年代初，Hirst发明通风式花粉采集器，利用气室产生一定速度的气流撞击载玻片，花粉就被粘合剂黏住(杨颖，2007)。然后在室内应用生物光学显微镜或荧光显微镜对载玻片捕获的转基因花粉进行分类识别并按“日”定量计算。

自然重力法优点是以自然沉降为基础，没有干扰花粉的自然分布规律，不足就在于花粉采集和数据读取，需要大量人力。而动力通风采集法优点是可以准确测量收集的气体体积，但利用气室产生气流，人为改变作物花粉的局部自然条件，对研究花粉的自然分布规律有一定影响。并且这两种方法均不能获得建立转基因花粉在自然环境中传播定量安全评估模型所需的具有足够时空分布精度的花粉按“时”实测资料。综合上述两种方法优点，研制出一种既不干扰花粉的自然沉降，又能获得高时空分辨率的转基因花粉自动采集传感器。该仪器能自动对花粉进行数字显微成像并对采集的花粉进行分类处理，按“时”自动生成四维时空分布的转基因花粉资料。作物花粉自动采集传感器依照Durham提出的方法，通过单片机控制简易机械臂操作采样平台上的载玻片(其上涂有凡士林作为粘合剂)置于转基因作物自然生长环境中捕获空气中自由逃逸花粉，按设定时序，将采样载玻片置于生物显微镜下，利用CMOS(complementary metal-oxide-semiconductor)视频传感器将生物显微镜生成的光学图像转换成数字图像，经嵌入式ARM(advanced RISC machines)单片机计算处理并存储。2009年9月11—24日，在江苏省农科院溧水植物种植基地，该仪器用于转基因玉米和转基因水稻的花粉采集，取得大量玉米花粉及水稻花粉的实测资料。在距离花粉源相同距离、相同高度处，同一天(时)采集数据对比。自然重力法测得的玉米平均花粉密度为46.83粒/(cm2·h)、水稻平均花粉密度132.88粒/(cm2·h);仪器测得玉米平均花粉密度为31.2粒/(cm2·h)、水稻平均花粉密度189.32粒/(cm2·h)，仪器所获资料与传统人工观测值基本一致。图1是采集逃逸花粉图像。

图1 传感器采集的水稻花粉图像Fig.1 Image of rice pollen captured by the sensor

1.2 硬件组成及主要功能

该传感器由数控简易机械臂、单目生物显微镜、CMOS视频传感器、嵌入式ARM微处理器、风向标控制的转动平台、电源等单元组成(图2)。

图2 硬件结构示意图Fig.2 Schematic diagram of the hardware

1)数控简易机械臂:由可编程控制器、驱动器、3个步进电机及传动机构组成。通过3个步进电机实现采样平台的自由移动。0#电机控制显微镜在调焦时的上下移动;1#电机控制载玻片的左右移动;2#电机控制载玻片的前后移动。组合起来就可以实现显微镜对载玻片的调焦与拍摄时的视野控制。电机控制的最小移动步距是微米量级，可实现准确的对焦和移动。2)单目生物显微镜:由传统生物显微镜进行改装而成。与传统显微镜不同的是将显微镜的目镜部分换成CMOS视频传感器，将物镜看到的内容显示在CMOS传感器上，然后将CMOS生成的图像信号传输到ARM控制数据采集器。3)CMOS视频传感器:通过CMOS成像技术将显微镜下的光学图像转换成数字图像，便于后期的资料采集和处理。4)嵌入式ARM微处理器:利用ARM单片机控制CMOS视频传感器拍照，采集花粉图片并暂时储存数据资料。5)存储设备SD卡:存储ARM中FLASH的数据，利于后期资料存储、处理和分析。6)电源:24 V便携式锂电池，使仪器能长期野外运行，不用外接电源。整个仪器置于防风避光的密封罩内，并固定在能自由转动的平台上，通过附带的风向标可使仪器随风向的变化而自动调整方向。控制器自动操作简易机械臂按设定的时间顺序，将载玻片从密封罩的窗口置于作物生长的田野中采集花粉，或将退回罩内置于显微镜下经过自动对焦进行摄像。转动平台固定在高度可调的三脚架上。

2 仪器定标

不同作物花粉外形结构不同，从不同角度观察可呈圆形、椭圆形、菱形等不同形状，且当花粉粘连重叠时花粉形状更为复杂，不易区分识别。而且单粒花粉尺度在数十微米，自动识别不同的花粉类型，定量估算单位面积上的花粉密度，必须对数字显微图像的光学放大率、几何失真进行定标估计，同时还需对载玻片的显微拍摄抽样率进行定量估计，即对载玻片进行多少次显微抽样拍摄可获得代表性的单位面积花粉密度。

2.1 仪器的安置

图3中间是花粉自动采集传感器，传感器正对玉米试验田采集玉米花粉(下风方向)。仪器两侧支架放置载玻片采集花粉，与传感器采集数据进行比对。

图3 作物花粉自动采集传感器Fig.3 Crop pollen auto-acquisition sensor

2.2 几何尺度定标

由数字相机拍摄的图片是对应物镜下视场经生物显微镜放大以及CMOS转换成像，为计算显微视场真实几何面积S(单位:mm2)及花粉尺度和形状，需对图片光学放大倍数F(无单位标量)进行几何定标并对成像过程中产生的几何失真进行评估。用标准医用血球计数板XB-K-25(图4)进行拍摄定标。血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成，玻片中有4条下凹的槽，构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，其上均有一个方格网，每个方格网上刻有9个大方格(图5)，中间的一个大方格A作为定标室。定标室长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，其容积为0.1 mm3。定标室又分成25个中格，中格又进一步的分成16个小格，这样一个定标室共分400个小格，每小格面积是1/400 mm2，小格的行间距Δx(单位:mm)为1/20 mm，即Δx=0.05 mm。

图4 血球计数板俯视图Fig.4 Planform of blood cell count plate

图5 方格网放大图Fig.5 Grid Enlargement Figure

定标时，将血球计数板水平放置于仪器载物平台上，调节平台控制系统，使血球计数板定标室A置于显微物镜视场中央，并在CMOS传感器上呈现清晰的网格图像(图6)，图6中黑点是镜头附着的灰尘。

图6 定标网格图Fig.6 Calibration grid figure

在调节过程中，要求视野中的网格线与图像边缘基本平行，拍摄时控制两者误差在一个像素，即控制图6中同一水平线两点i、j纵坐标之差小于1，通过换算图中一个像素放大前的真实尺寸为0.001 mm。后将拍摄成像的定标网格图保存到存储设备。通过测量定标网格图6中c、e两点坐标(x1，y1)、(x2，y1)，计算标准小方格放大后间距D(单位:mm)，进而可得系统的光学放大倍数F，即F=D/Δx。从整个评估分析测量过程中发现，采样点位置、采样点小方格边界清晰度、人为测量误差等影响测量结果，为提高评估精度，减少读数误差，通过数控简易机械臂微调血球计数板位置，重新拍摄存储，如此循环完成8组相互独立定标图像的采集，每张定标网格图读取20个小方格，如图7所示圆点所示小方格，读数点整体分布是从图片中心向外辐射的形状，且读数点均匀分布。对每幅图读取的20个数据去掉极端值，求出平均¯D(单位:mm)，并计算F(图8)，图8中标准小方格放大间距¯D分布在16.300～16.500 mm之间，相应的光学放大倍数F为326～330，取F=328作为定标值。

图7 采样点分布示意图Fig.7 Distribution of sampling points

用于读取样本资料的显微镜视场实际面积S是CMOS成像图片面积与系统线性放大倍数F2之比，即S=lh/F2。式中l、h分别为图片长和宽，l=45.16 cm、h=36.12 cm。那么视场真实面积S=1.516 mm2。

光学系统几何失真分布不均，即光学放大倍数F随距图片中心距离R(单位:mm)改变而变化，因此在成像图片的不同位置，估算同一花粉的尺度结果不同。在R相等的距离圈处，光学放大倍数F均值相等，所以取45°最长轴研究光学放大倍数F变化。以定标图片中心为原点，水平方向为X轴，垂直方向为Y轴建立直角坐标系。在前面读数的基础上，于45°方位对角线上添加等距的4个测量点，如图7中“+”所示。将45°对角线上测得的标准小方格放大间距D(单位:mm)，按距离中心原点的距离R见图9。

图8 小网格间距¯D(a;单位:mm)与光学放大倍数F(b)Fig.8 (a)Small grid spacing¯D(units:mm)and(b)optical magnification F

随离原点距离R的增大，标准小方格放大后在图像上呈现的间距D在逐渐减小，距离R越大，D减小的幅度也越大，D的拟合曲线方程为

相应的光学放大倍数F=D/Δx的拟合曲线为

F的变化规律与系统的几何光学特性有关，在放大成像过程中，图像边缘的几何失真大于中心的几何失真。

图10中玉米花粉粒B距离图片中心距离R=75.44 mm，其面积Q=5.25 cm2，相对的FR=328.56，

图9 45°方向上小方格间距D随距离R的变化Fig.9 Variation of small square spacing D with R on the 45°direction

那么其真实面积QR=0.004 86 mm2。在图片中心处F'=330.68，若将目标花粉B置于中心的真实面积Q'=0.004 8 mm2，若将目标花粉B置于图像的左下角，则对应的面积为0.005 46 mm2，两者订正真实面积之差ΔQ=0.000 66mm2，是中心订正真实面积Q'的13.75%。这一误差对利用资料计算花粉密度，累积花粉个数无影响。但当计算花粉几何尺度必须对原始资料进行几何订正，否则结果误差较大。

2.3 载玻片拍摄抽样定标

载玻片拍摄抽样定标指确定仪器使用时，对每张载玻片抽样拍摄多少张图片可获得准确的单位面积花粉密度。抽样数目N(单位:张)的确定主要受两个因素影响，一是精度，精度越高，效果越好;二是仪器效率，在精度一定的情况下，还要求仪器有更高的拍摄效率。

众所周知，总体样本数一样时，抽样的数目越多，抽样精度就越高。利用外场实验采集的水稻和玉米花粉资料，计算一张载玻片上不同拍摄抽样数的单位面积花粉密度。对不同拍摄抽样数时的花粉密度与最大抽样(样本数目最多)时的花粉密度进行相关性分析(图11)。

图10 玉米花粉图Fig.1 0Maize pollen picture

图11 水稻花粉和玉米花粉抽样相关系数Fig.1 1Sampling correlation coefficient of rice pollen and maize pollen

如图11所示，玉米花粉和水稻花粉抽样相关系数随拍摄抽样数的增加增大。说明在总体样本数一样的情况下，拍摄抽样的数目越多，那么抽样精度就越高。但是拍摄抽样数目越大，拍摄图片的时间就会越长，使得仪器效率下降。由图11可见在使用本仪器采集基因花粉时，当抽样数目N大于50，相关系数大于95%。

另从图11还可以看出，当取前40个拍摄抽样时，相应的玉米花粉密度的相关系数较水稻的小很多，主要是因为两者单位面积花粉密度不同。图12给出了不同花粉密度对抽样结果的影响，可见，在不同拍摄抽样数时，玉米花粉和水稻花粉的花粉密度与最大抽样(样本数目最多)时花粉密度的相对误差曲线。

图12 水稻玉米在不同浓度下的相对误差Fig.1 2Rice and maize pollen relative error at different densities

在采集基因花粉过程中，其他硬件条件不变，影响结果主要因素是花粉浓度。从图12中所示，水稻花粉密度大，均值在180粒/cm2以上，其对应的相同面积抽样相对误差在30%以下，并且随着拍摄抽样数增大而减小，但是其变化幅度不大。而玉米组，其单位面积花粉密度很小，而相同面积上抽样的相对误差的变化范围大。当取前20视场观测数据时，其相对误差达到44%以上。后随拍摄抽样数的增大，相对误差逐渐减小。当拍摄抽样数为50张时，相对误差降到28%。所以拍摄抽样数在作物基因花粉浓度较小时，对抽样精度的影响大于作物基因花粉浓度较大的时候。因此在要求抽样精度一定时，花粉浓度大时，可适当减少其抽样数目。

3 总结

研制的作物花粉自动采集传感器通过ARM控制简易机械臂操作采样平台上的载玻片，将其置于作物自然生长的环境中捕获空气中自由扩散的花粉粒子，按设定的时序，将采样载玻片置于生物显微镜下，用CMOS视频传感器将生物显微镜生成的光学图像转换成数字图像，经嵌入式ARM单片机计算处理并存储。

利用外场实测资料和标准医用血球计数板，对仪器进行几何尺度标定及载玻片拍摄抽样定标。仪器光学放大倍数F定为328，视场真实面积S为1.516 mm2，当拍摄抽样数N为50次时，相关系数大于95%。

由于几何失真系统光学放大倍数F，呈现从图片中心向四周扩散的抛物线形变化规律，即F=－0.000 42R2+0.003 6R+330.68，其中R是图片中任意一点距离图片中心的距离。实测取样面积误差最大可达13.75%。这一误差对利用资料计算花粉密度，累积花粉个数无影响。但当计算花粉几何尺度必须对原始资料进行几何订正，否则结果误差较大。

最后分析花粉浓度对拍摄抽样定标影响，当抽样精度一定，花粉浓度大时，可适当减少抽样数目。水稻单位面积花粉密度大于玉米单位面积花粉密度，要求抽样精度为90%时，水稻花粉需要拍摄抽样40次，而玉米花粉则需要拍摄抽样80次。

陈万隆，肖静玢.1995.混合层厚度、风速和稳定度对地面SO2浓度分布影响的数值试验［J］.南京气象学院学报，18(4):548-554.

陈兴玲，胡建军，赵楠木.2007.转基因植物基因漂移研究［J］.安徽农业科学，35(10):2851-2852;2867.

胡平，姚国新，盛继群.2006.转基因作物安全性研究进展［J］.安徽农业科学，34(16):3955-3956;3961.

李仁忠，刘寿东，胡凝.2007.转基因水稻花粉扩散模拟方法研究［J］.内蒙古气象(4):31-34;45.

刘寿东，李仁忠，胡凝.2008.南京开花期稻田贴地层微气象特征研究［J］.安徽农业科学，36(16):6701-6703;6707.

罗蒋梅，王建林，申双和，等.2009.影响小麦产量的气象要素定量评估模型［J］.南京气象学院学报，32(1):94-99.

钱迎倩，田彦，魏伟.1998.转基因植物的生态风险评价［J］.植物生态学报，22(4):289-299.

宋小玲，强胜，刘琳莉，等.2005.抗除草剂转基因作物基因流及其安全性评估方法的探讨［J］.农村生态环境，21(3):74-77.

魏玉香，童尧青，银燕，等.2009.南京SO2、NO2和PM10变化特征及其与气象条件的关系［J］.大气科学学报，32(3):451-457.

杨颖.2007.北京城区树木花粉飘散规律及影响因素研究［D］.北京:北京林业大学.

赵莉莉，刘寿东，胡凝.2009.水稻花粉扩散源强估算方法研究［J］.安徽农业科学，37(23):10833-10834;10837.

朱琳，佟玉洁.2003.中国生态风险评估应用探讨［J］.安全与环境学报，3(3):22-24.

Hu N，Lu C G，Yao K M，et al.2007.Multi-model establishment and application for water and heat transfer in paddy rice fields［J］.Scientia Meteorologica Sinica，27(2):203-208.

Jia S R.2004.Enviromental risk assessment of GM crops:Progress in risk assessment［J］.Sci Agri Sinica，37(2):175-187.

Song Z，Lu B R，Chen J.2004.Pollen flow of cultivated rice measured under experimental conditions［J］.Biodiversity and Conservation，13(3):579-590.

Wang F，Yuan Q，Shi L，et al.2006.A large-scale field study of transgene flow from cultivated rice(Oryza sativa)to common wild rice(O.rufipogon)and barnyard grass(Echinochloa crusgalli)［J］.Plant Biotechnology，4:667-676.

Yao K M，Hu N，Chen W L，et al.2008.Establishment of a rice transgene flow mode for predicting maximum distances of gene flow in southern China［J］.New Phytologist，180:217-228.

Yuan Q H，Shi L，Wang F，et al.2007.Investigation of rice transgene flow in compass directions by using male sterile line as a pollen detector［J］.Theoretical and Applied Genetics，115:549-560.