皖南地区乙型肝炎病毒基因型和亚型的分布特征

宋骏，夏长胜

(1.皖南医学院附属弋矶山医院检验科，安徽芜湖241001;2.北京大学人民医院检验科，北京100044)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)为嗜肝双链DNA病毒，是最重要的肝脏疾病致病因子。根据乙型肝炎病毒(HBV)全基因组序列差异≥8%或S基因序列≥4%，将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H等8个基因型[1，2]，同时据全基因序列异质性≥4%而≤8%将HBV同一种基因型再分为不同的亚型[3]，如:A基因型可分为Aa和Ae亚型;B基因型可分为B1(Bj)、B2(Ba)、B3和B4亚型;C基因型可分为C1、C2、C3和C4亚型等。

据报道HBV基因型或亚型的分布呈一定的地理区域性[4]。因此，分析不同地区基因型或亚型的分布，使用分子流行病学方法研究其流行势态对乙肝的防治具有重要意义。

皖南地区是以汉族为主的民族聚居地，有关HBV感染的基因型及亚型研究鲜有报道。本研究拟对皖南地区HBV感染者进行基因型和亚型的检测，以期了解HBV基因型的地区分布特点及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象皖南医学院附属弋矶山医院就诊的319例HBV感染患者被纳入研究，其中急性乙型肝炎10例，慢性乙型肝炎231例，肝硬化43例，肝细胞癌8例，以及无症状携带者27例。所有患者血清HBV DNA检测为阳性。选择患者来我院就诊的首次HBV DNA阳性血清标本进行基因型及亚型检测。

1.2 主要试剂核酸提取试剂购自Promega公司;PCR试剂购自宝生工程(大连)有限公司。

1.3 血清DNA提取严格按照说明书的操作进行。

1.4 引物设计参考文献[5，6]，引物序列见表1所示;引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。

表1 HBV型特异性引物分型法的引物序列

1.5 HBV基因型检测HBV基因分型采用多对引物和巢式PCR法。第1轮PCR以提取的HBV DNA为模板，按95℃10 min;94℃20 s，55℃20 s，72℃1 min，扩增40个循环;72℃延伸7 min。第一轮PCR产物作为第2轮PCR的模板，按95℃10 min;94℃20 s，65℃20 s，72℃30 s，扩增40个循环;72℃延伸7 min。取第二轮PCR产物10 μl，经2%琼脂糖100V电泳20min，观察结果。HBV各基因型产物为:A基因型为68 bp，B基因型为281 bp，C基因型为122 bp，D基因型为119 bp，E基因型为167 bp，F基因型为97 bp。

1.6 HBV亚型检测Ba亚型:扩增前C区和C区检测B基因型的亚型。第一轮PCR按96℃2 min;94℃15 s，55℃45 s，72℃45 s，扩增40个循环;72℃延伸7 min;第二轮PCR以第一轮产物为模板按96℃2 min;94℃15 s，55℃45 s，72℃45 s，扩增40个循环;72℃延伸7 min，取第二轮PCR产物10 μl，经2%琼脂糖100 V电泳20 min，观察结果。Ba亚型的PCR产物为110 bp。Bj亚型的反应体系、反应条件与Ba亚型相同，仅引物不同，其PCR产物也为110 bp。C1基因亚型:扩增P区检测HBV C基因型的亚型。按95℃10 min;94℃15 s，55℃45 s，72℃30 s，扩增40个循环;72℃延伸7 min，取PCR产物10 μl，经2%琼脂糖100V电泳20 min，观察结果。Cl亚型的PCR产物大小为340 bp。C2亚型的反应体系、反应条件与Cl亚型的相同，仅将引物反义链换为HBVC2R。其PCR产物大小为240 bp。1.7PCR直接测序将PCR分型产物测序，以确定分型的准确性。PCR产物纯化和测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。运用Clustal W和Blast软件进行序列比对和同源性分析。

1.8 统计学处理计量资料的比较，对于多组采用方差分析和q检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV基因型及分布285例患者中，B基因型162例(57%)，C基因型49例(17%)，B+C混合基因型74例(26%)，未发现A、D、E、F型。HBV基因型分析，见HBV DNA扩增产物电泳图1所示(图1)。其中B基因型扩增片段为281 bp;C基因型扩增片段为122 bp。

图1 HBV DNA基因型扩增产物电泳图

2.2 HBV亚型检测结果162例B基因型中以Ba亚型为主，未发现Bj亚型，其中Ba及Bj亚型扩增产物均为110 bp，无法具体区分;本研究通过基因测序确定全为Ba亚型。49例感染C基因型患者中，C1亚型38例(78%)，C2亚型9例(18%)，未分型2例(4%);C1亚型扩增产物340 bp，C2亚型扩增产物为240 bp。见HBV DNA扩增产物电泳图2所示(图2)。

图2 HBV DNA亚型扩增产物电泳图

2.3 HBV基因型同HBV DNA水平的关系目前认为，乙肝发病机制是HBV病毒诱导的免疫反应，而血清中高滴度的HBV是乙肝发病的危险因素之一，HBV的复制状态与其基因型之间有无关系存在争议，同时HBV DNA水平作为乙型肝炎疗效的主要观察指标，具有十分重要意义。所以我们把不同基因型的HBV DNA水平做了比较。

表2 不同HBV基因型感染者血清HBV DNA水平比较

3 讨论

HBV感染在世界各地均有不同程度的流行，其地区差异非常明显。除与卫生状况、生活习惯、人体免疫、遗传特征等因素明显相关外，还与病毒本身生物学特基因型、血清亚型、基因变异等有关。我国HBV基因型主要以B基因型和C基因型为主，并有少数D基因型和A基因型，北方以C基因型为主，南方B基因型逐渐增多且为主要基因型[7]。本次对皖南地区人群HBV分子流行病学研究结果与国内的相关报道基本符合[8]。但发现最显著的特点是B+C混合基因型感染占很大比例(26%)。可能与皖南地区人口稠密，近年来经济发展迅速且人口流动性较大，人群间生活习俗各不相同又相互影响有关。

目前，人类感染HBV病毒的基因型别可能与感染途径、疾病的感染谱、疾病的进展有一定的相关性。在以B型和C型为主的亚洲，大量的证据表明[7，9，10]:C基因型与严重肝病相关，和B型相比预后较差。不同的HBV基因型可能代表着HBV变异及复制能力的不同。HBV在体内受到机体免疫和抗病毒治疗的双重压力，其基因突变是为了适应外界环境变化。HBV基因变异如前C区1986、BCP区A1762T/G1764A突变等都很常见。邓永东等[11]报道C型的BCP双突变率明显高于B型，推测A1762T/G1764A双突变可能是造成C型患者比B型存在更严重肝损害的原因之一。

同时对皖南地区285例HBV感染者进行血清HBV DNA水平检测，B型和C型患者差异无统计学意义，但都高于B、C基因型混合感染患者，其差异均有统计学意义(P＜0.05)。仅从血清HBV DNA水平难以鉴别B型和C型何者更易发展为严重的肝病。需要进一步的研究探讨其临床意义。

研究检测皖南地区162例B基因型感染的患者，通过基因测序确定为Ba亚型，未发现Bj亚型;B基因型中以Ba亚型为主与既往研究相符[12]。49例感染C基因型患者中，C1亚型38例(78%)，C2亚型9例(18%)，未分型2例(4%)，说明该地区人群感染的C型主要为C1亚型。完成HBV基因型及亚型分布的初步调查后，进一步的研究可以从HBV基因亚型水平上探讨其临床疾病谱及抗病毒治疗效果的关系。

总之，研究显示皖南地区HBV感染人群中B基因型最流行，其次是B及C基因混合型。B基因型完全为Ba亚型，而C基因型中C1亚型为优势亚型。

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