类风湿关节炎患者外周血白细胞介素-23和类风湿因子的表达研究

张国华 ，吕 智

1.山西医科大学第二临床医学院，山西太原 030001；2.山西医科大学汾阳学院，山西汾阳 032200

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜组织慢性炎症病变为主要表现的器官特异性自身免疫性疾病，主要病理特征是慢性炎症细胞（T细胞和巨噬细胞）浸润和多种细胞因子分泌，最终导致关节滑膜渐进性损伤及骨质破坏，给患者带来了很大的痛苦[1]。其病因和发病机制至今尚不完全清楚，在我国，RA的患病率为0.32%～0.36%，是造成人类劳动力丧失和致残的主要因素之一[2]。近年来，大量研究证实，RA患者滑膜细胞及滑膜组织中浸润的单核/巨噬细胞、淋巴细胞等可产生大量的细胞因子和炎症介质，参与RA的致病过程[3-4]。

白细胞介素23（IL-23）属于IL-12家族成员，是一种重要的炎症细胞因子，在抗感染免疫、抗肿瘤免疫及自身免疫性疾病中发挥重要作用[5]。IL-23可能与RA炎症反应、血管新生、关节软骨、滑膜病变之间存在一定的内在联系，目前国内对IL-23在RA早期诊断和治疗等方面的相关报道较少，故从基因水平和蛋白水平探讨IL-23在RA患者体内的表达及其与RF的关系，为RA的早期诊断和进一步阐明RA的发病机制提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

66例RA患者均来自山西省汾阳医院门诊或住院患者，均符合1987年美国风湿病学会（ARA）制定的类风湿关节炎诊断标准，其中，男 24例，女 42例；年龄 27～65岁，平均（47.3±7.2）岁。均排除高血压、糖尿病、肝肾疾病、感染、肿瘤、心脑血管疾病和其他自身免疫性疾病等。42例健康对照组为健康体检者，其中，男14例，女28例；年龄23～66岁，平均（46.5±7.8）岁。

1.2 临床标本的采集

所有研究对象采集空腹静脉血2管，第一管全血3 ml，置于肝素抗凝管中，用于分离外周血单个核细胞（PBMC）。第二管无抗凝剂3 ml，静置30 min，离心后取血清，用于酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-23和免疫比浊法检测血清RF水平。

1.3 外周血单个核细胞的分离

抽取3 ml淋巴细胞分离液（购自北京索莱宝科技有限公司）于无菌离心管中，将新鲜无菌留取的3 ml肝素抗凝血用等体积（3 ml）无菌生理盐水（1∶1）稀释后，缓慢加入到已装有淋巴细胞分离液的离心管中，水平离心机离心（2 000 r/min，20 min），吸取中间的白膜层（PBMC），用5倍体积的无菌生理盐水洗涤2次，最后用无菌生理盐水稀释至细胞浓度为1×107/ml。

1.4 RNA提取和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

1.4.1 RNA提取 将上述分离的PBMC按5×106个细胞中加入1 ml Trizol溶液，反复吹打使细胞彻底裂解。按1 ml Trizol加 200 μl氯仿（5∶1），剧烈震荡 15 s，室温静置 5 min，4℃离心（12 000 r/min，15 min），小心吸取上清，按与上清 1∶1 的比例加入异丙醇（约 450 μl），上下颠倒混匀后，-20℃静置 60 min，4℃离心（12 000 r/min，10 min），仔细将液体倒掉，加入 1 ml 75%的乙醇（DEPC 水配制），4℃离心（12 000 r/min，10 min）洗涤沉淀1次，加入适量DEPC处理水（20 μl）溶解 RNA，测OD值定量，以A260/A280，A260/A230比值判断RNA样品质量，-70℃冰箱保存备用。

1.4.2 引物设计 根据GenBank人IL-23p19 cDNA序列设计引物，以β-actin作为内参照。引物序列由上海英俊生物技术有限公司合成。IL-23p19（328 bp）：上游引物（5′-CTGCTTGCAAAGGATCCACC-3′），下游引物（5′-TTGAAGCGGAGAAGGAGACG-3′）。 β-actin（600 bp）：上游引物（5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′），下游引物（5′-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3′）。

1.4.3 RT-PCR 选用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，按试剂盒说明书操作，通过预实验确定PCR反应条件和最适循环数，以保证PCR产物量与起始mRNA量呈线性相关。反应结束后取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析仪（江苏捷达科技发展有限公司）上观察拍照，分析电泳条带的光密度值，以β-actin作内参照，用相对光密度值代表mRNA的表达量。相对光密度值=（IL-23p19光密度值/β-actin光密度值）×100%。

1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）

采用双抗体夹心ABC-ELISA法，人IL-23 ELISA检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司（批号：SX01087），操作过程均严格按试剂说明书操作。采用BIO-RAD伯乐酶标仪680于492 nm波长处测定OD值，通过绘制标准曲线计算样本的浓度。

1.6 免疫比浊法

检测血清RF用OLYMPUS全自动生化分析仪（北京九强公司），所用试剂为原装配套试剂，检测正常范围＜14 IU/ml。

1.7 统计学分析

所有数据均采用SPSS 11.5软件进行统计学分析。数据用均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。各指标间的相关性检验采用Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 RA患者与健康对照者PBMC中IL-23p19 mRNA表达水平比较

RT-PCR电泳图中可见，健康对照组和RA患者组在328 bp处都有条带出现，但在RA患者组的表达强度明显高于对照组（图 1、表1），说明RA患者PBMC中 IL-23p19 mRNA的平均表达水平较健康对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表达水平（±s）Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)

表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表达水平（±s）Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)

注：与健康对照相比，*P＜0.05Note：compared with the healthy group,*P＜0.05

RA组健康对照组组别 例数66 42 IL-23p19 mRNA（%）45.2±11.7*23.8±9.5血清 IL-23（ng/L）114.47±42.70*70.81±28.85

2.2 RA患者与健康对照者血清IL-23水平比较

RA患者血清中IL-23水平较健康对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 RA患者IL-23与RF之间的相关性分析

RA患者血清IL-23含量与RF含量无明显相关性（r=0.389，P＞0.05)。

3 讨论

类风湿关节炎是多因素自身免疫性疾病，其病因及发病机制仍不十分清楚，现在免疫机制越来越受到国内外专家的关注。RA患者体内多种细胞因子和炎症介质异常表达，它们之间通过相互作用、相互调节，形成一个复杂的网络，可能直接或间接参与RA的发生和发展过程[6]。IL-23是2000年报道的细胞因子，是由p19和IL-12p40共同形成的类似于IL-12p35p40的、由二硫键连接的异源二聚体可溶性复合物。其功能研究证明，p19单独不具有生物学活性，只有与p40共同构成p19p40时才有生物学活性。IL-23虽然与IL-12共有p40亚单位，但以其自身独特的亚单位p19与IL-12相区别。IL-23具有十分复杂的生物学功能，主要作用于记忆性CD4+T细胞，诱导Th1型细胞的分化及IFN-γ产生[7]，还可作用于记忆性Th17细胞亚群诱导产生IL-17，参与免疫炎症[8]。过去人们认为IL-12在自身免疫性炎症发挥中心作用，现在越来越多的研究表明在强直性脊柱炎（AS）、桥本甲状腺炎（HT）等患者体内IL-23的表达明显增高[9-10]，所以IL-23在这些自身免疫性疾病的发展过程中可能发挥着重要的作用。但目前对于IL-23在RA发病中的作用没有研究报道，本研究结果表明IL-23p19 mRNA和血清IL-23在RA组的表达水平都显著高于正常对照组，差异具有统计学意义，说明IL-23参与了RA的炎症过程，但具体作用机制有待进一步研究。

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