超声强化超临界提取大黄中5种蒽醌衍生物的研究

李卫民， 王治平， 刘 杰， 叶雪兰， 邱志兵， 李庆国

(广州中医药大学中药学院，广东广州510006)

大黄来源于蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经之功，用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽，湿热黄疸等［1］。其主要成分为蒽醌衍生物，制剂多采用煎煮法提取［2］，蒽醌类成分因受热时间过长而降解，致通肠作用明显减弱［3］，同时也影响提取率。超临界流体萃取(SFE)技术在很大程度上避免了传统提取过程的缺陷，并且属于环境友好的绿色提取技术［4-5］。但是，该技术也存在一些需要解决的问题，如高压操作，对设备的要求高，萃取效率有待进一步提高等［6］。超声能产生空化效应，具粉碎、搅拌、乳化等特殊作用，使植物组织在溶剂中瞬时产生的空化泡的崩溃，而使组织中细胞破裂，以利于溶剂浸透到植物细胞内部，使植物中的有效成分溶于溶剂之中［7］。目前已有相关文献报道将超声技术引入到SFE萃取中，并探讨了超声参数对萃取率的影响［6］。

本试验采用自行设计改造的超声强化超临界流体萃取装置，以大黄药材中5种蒽醌衍生物成分为提取对象，比较超声提取(U)、超临界流体萃取(SFE)和超声强化超临界流体萃取(USFE)提取大黄5种蒽醌衍生物成分的提取率。为开发植物药有效成分提取新技术和大黄及其复方制剂的工业化生产提供参考。

1 仪器与试药

超临界提取装置(江苏华安科研仪器有限公司，5 L)，超声波发生器(广州华南超声设备有限公司，超声强度2 000 W，频率20 kHz)，超声强化超临界提取装置(自行设计，由上述2种设备改装而成)示意图见图1;CO2气体购于广州亿祥贸易公司供应，纯度达99.5%以上;SHIMADZU LC-10AT vp plus高效液相色谱仪，SHIMADZU SPD-10A vp plus紫外检测器，SHIMADZU CBM-10A vp plus化学工作站;Sartorius CP225D电子分析天平(德国，d=0.01 mg);盐酸、三氯甲烷、甲醇、乙醇等为分析纯，水为制备纯水。对照品由中国药品生物制品检定所提供(含量测定用，批号分别为:芦荟大黄素110795-200605，大黄酸110757-200206，大黄素110756-200110，大黄酚110796-200615，大黄素甲醚110758-200610)。大黄药材购自广州中医药大学大药房有限公司，由本院李薇教授鉴定为廖科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.干燥根及根茎。

图1 超声强化超临界提取装置示意图

2 方法与结果

2.1 大黄的预处理 取大黄饮片，粉碎，过100目筛，混匀，即得。

2.2 大黄蒽醌类成分的提取 参照大黄SFE提取的稳定工艺参数［8］，采用平行试验的方法，比较超声、超临界和超声强化超临界的提取效果。

2.2.1 超声提取(U)［9-10］称取大黄粉末100.0 g，置1 L萃取釜中，加4 BV乙醇超声提取2 h(超声强度:1 000 W，间歇2 min工作)，从放料口收集乙醇提取液，50℃减压回收至无乙醇滴出，得萃取物。

2.2.2 超临界提取(SFE)［5，8］称取大黄粉末 100.0 g，置 1 L萃取釜中，按如下条件萃取2 h:夹带剂乙醇用量2 BV，萃取压力18 MPa，萃取温度50℃，分离压力5 MPa，分离温度35℃，收集萃取液，50℃减压回收至无乙醇滴出，得萃取物。

2.2.3 超声强化超临界提取(USFE) 称取大黄粉末100.0 g，置1 L萃取釜中，按如下条件萃取1.5 h:超声强度:1 000 W，间歇2 min工作，夹带剂乙醇用量1.5 BV，萃取压力18 MPa，萃取温度40℃，分离压力5 MPa，分离温度35℃，收集萃取液，50℃减压回收至无乙醇滴出，得萃取物。

2.3 供试溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 按文献方法制备［1，11］，即得每1 mL 中含芦荟大黄素16.133 μg、大黄酸15.601 μg、大黄素 15.092 μg、大黄酚 16.117 μg、大黄素甲醚 8.109 μg 的混合对照溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取上述萃取物0.1 g，置烧瓶中，同药典大黄药材含量测定项下方法，自“加8%盐酸溶液，超声2 min，再加三氯甲烷10 mL”起同法制备供试液，再用甲醇稀释10倍，摇匀，滤过，即得。

2.4 色谱条件［1，12］色谱柱:Kromasil 100-5 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，加预柱;流动相:甲醇 -0.1%磷酸溶液(85∶15);体积流量:1.0 mL/min，柱温:30 ℃，进样量:10 μL，检测波长:254 nm。

2.5 线性关系考察 精密吸取混合对照溶液1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μL，注入液相色谱仪，测定，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品进样质量(ng)为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表1。

2.6 样品测定 精密吸取上述对照溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定并计算各成分质量分数，色谱图见图2，结果见表2。

表1 各对照品线性关系考察结果

图2 蒽醌衍生物HPLC测定色谱图

由表2可知，提取物中蒽醌衍生物量高低:超声强化超临界提取＞超临界提取＞超声波提取;提取物中蒽醌衍生物的提取率大小:超声强化超临界提取＞超声波提取＞超临界提取。因超声波提取时溶剂用量较多，提取物得率较高，使其对蒽醌衍生物的提取率有所提高。

试验表明，超声强化超临界流体提取大黄5种蒽醌衍生物的量及提取率均高于单独的超声和超临界提取。

2.7 验证试验 上述试验过程中收集萃取物时发现萃取物的颜色变化，由褐黄色变为鲜黄色再变为淡黄色。为探讨此现象的原因并验证超声强化超临界提取工艺，进行如下试验。提取条件:萃取温度为40℃，提取时间1.5 h，超声强度1 000 W，夹带剂乙醇用量为2 BV，每0.5 BV收集萃取物，测定蒽醌衍生物量和提取率。结果见表3。

表2 不同提取方法对大黄蒽醌衍生物提取效果试验结果 (n=2)

表3 不同时段收集萃取物中大黄蒽醌衍生物测定结果 (n=2)

由表3可知，第2个0.5BV萃取物中的蒽醌衍生物量及提取率最高，第1个0.5BV次之，第3个0.5BV最低。第2个0.5BV萃取物中大黄酚量高达81.638%，如果欲制备高含量的有效部位，可以采取分段收集的方法。

3 结论与讨论

3.1 试验结果表明，USFE的合适萃取温度、萃取时间和夹带剂用量分别低于SFE的10℃、30 min、0.5 BV，在相同的萃取压力下，USFE对5种蒽醌衍生物成分的提取率较SFE分别提高2.113%～6.095%。超声强化超临界流体提取大黄5种蒽醌衍生物的量及提取率均明显高于单独的超声和超临界提取。

3.2 研究显示，超临界提取和超声波提取技术在中药提取分离方面具有广泛的应用前景，两者的成功联用尚未见相关文献报道，它对有效成分的提取纯化和制剂工艺研究具有巨大的推动作用，也为其他的中药产品工艺改进提供新的方法。

3.3 超声强化超临界流体提取技术成功整合了两者在提取方面的优势，避免了两者的劣势，减少夹带剂的用量，降低回收工作量及成本，避免萃取物中的有效成分长时间加热而被破坏，同时缩短提取时间，提高工作效率。

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