正交试验优选柘木多糖提取工艺研究

翟延君，伍伟超，王添敏，李波

(辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600)

柘木为桑科植物柘树Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur.的干燥根及藤茎，性甘温，无毒。具清热、凉血、通络之功效，主治妇人崩中血结，疟疾［1-2］。现代临床主要用于肿瘤放、化疗辅助药物，对消化系统肿瘤病人术后治疗疗效显著。目前“柘木糖浆”在临床上作为抗肿瘤制剂已有使用，该产品对食管、贲门、肠胃等消化系统肿瘤疾病疗效显著［3-4］。文献报道柘木多糖类成分具有增强免疫力的作用［5］，对其提取工艺的研究尚未见报道。因此实验采用正交试验L9(34)，以多糖量为评价指标，优化柘木多糖的提取工艺［6-9］，为柘木药材的开发利用提供理论参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器紫外可见分光光度计(UV24802型)，电子天平(上海天平仪器厂)。

1.2 材料柘木来源于桑科植物柘树Cudrania tricuspidata(Carr.)Bur.的干燥根及藤茎。本实验所用实验材料采自广西南宁市郊，由广西中医学院中药鉴定教研室廖月葵老师提供并鉴定。

1.3 试剂葡萄糖、浓硫酸、苯酚、95%乙醇、三氯甲烷、正丁醇、丙酮均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的绘制

2.1.1 标准溶液的配置精密称取干燥至恒重的葡萄糖粉末20.19 mg，至于100 mL量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，得浓度为0.201 9 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

2.1.2 标准曲线的制备精密量取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于6个试管中，加水至2.0 mL，再分别加入5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，然后迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀。室温放置45 min，在490 nm处测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标(mg/mL)，绘制标准曲线，得回归方程A=21.889C+0.003(r=0.999 5)，结果表明葡萄糖溶液在0.005～0.025 mg/mL线性关系良好。

2.2 柘木多糖的测定精密称取10.00 g干燥至恒重的柘木粉末(过20目筛)，加入25倍量95%乙醇，水浴回流60 min 2次后，挥干。干燥后的药材粉末，用25倍量的水在90℃水浴回流提取2 h，滤液sevage法去蛋白(sevage法:多糖溶液加入1/5体积的sevage试剂，强烈振摇。静置分层，除去交界处变性蛋白，重复处理9次)，减压浓缩。向浓缩液加入95%乙醇，至醇体积占总体积的85%，于4℃静置过夜。抽滤，沉淀经95%乙醇、丙酮各洗涤3次，真空干燥，得棕色粉末状的柘木多糖。粉末置于100 mL量瓶，加水定容，然后吸取1 mL样品溶液，按2.1.2项显色测量。

2.2.1 稳定性试验取同一样品溶液，分别放置0、15、30、60、120 min，按照2.1.2项下显色，测定吸光度，考察供试品的稳定性，结果RSD为1.22%，在2 h内吸收度基本无变化。

2.2.2 精密度试验另取样品6份，按照2.1.2项下显色，测定吸光度，考察方法精密度，结果显示精密度RSD为0.32%，符合药典规定。

2.2.3 重复性试验取同一批样品6份，按2.2项下方法提取，然后测定吸光度。结果测得吸光度的RSD为1.25%，符合药典规定。

2.2.4 加样回收率试验精密称取已知量的样品10.00 g，共5份。分别加入葡萄糖对照品约18 mg，按2.2项下方法提取，测定结果平均回收率为97.89%，RSD为0.51%，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.3 柘木多糖水提过程中单因素的影响研究

2.3.1 液料比考察精密称取10.00 g干燥至恒重的柘木粉末(过20目筛)4份，按2.2项下方法操作，用不同倍量的水提取，测定多糖量。每份平行做3次，结果取平均值。结果液料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1时，提取多糖质量分数分别为0.756、0.822、0.598、0.246 mg/g。可见在20倍时总多糖提取量最高。

2.3.2 提取时间考察精密称取10.00 g干燥至恒重的柘木粉末(过20目筛)4份，按2.2项下方法操作，在不同的时间下提取，测定多糖量。每份平行做3次，得平均值。结果提取时间为1、2、3、4 h时，提取多糖质量分数分别为0.620、0.675、0.830、0.808 mg/g。可见在3 h总多糖提取率最高。2.3.3提取温度考察精密称取10.00 g干燥至恒重的柘木粉末(过20目筛)4份，按2.2项下方法操作，在不同温度提取，测定多糖量。每份平行做3次，结果取平均值。结果提取温度为70、80、90、100℃时，提取多糖质量分数分别为1.178、1.322、1.949、1.670 mg/g，可见在90℃时总多糖提取率最高。

2.4 正交试验设计通过单因素实验确定最佳因素水平，为了消除各因素间的相互影响，根据这些确定的因素，确定正交因素的各个水平。进行正交实验设计，见表2～4。

表2 因素水平

表3 L9(34)正交试验结果

由方差分析可见，各因素对柘木总多糖提取效果的影响程度依次为C>A>B，提取温度对柘木多糖得率有显著影响，而提取溶媒倍量和提取时间无显著影响。因此，柘木总多糖的最佳提取工艺为A1B2C2，即10倍提取溶媒，提取温度为90℃，提取时间为3 h。

2.5 验证实验按实验所得最佳提取条件(10倍水，提取温度为90℃，提取时间为3 h)进行了4次验证试验，结果:平均总多糖质量分数为1.89 mg/g，RSD<3%(n=3)。

表4 方差分析

3 小结与讨论

3.1 实验对各因素分别进行了考察，结果发现当温度高于90℃或者提取时间长于3 h均能导致多糖提取量的下降，这是提取温度过高或者受热时间过长，导致部分多糖结构被破坏甚至降解，多糖提取率下降。

3.2 液料比考察结果当液料比为20∶1时总多糖的提取量最高，之后随着液料比的增大多糖的提取量开始下降，这可能是由于杂质溶出量增加而抑制了多糖的溶出，导致了多糖提取量的下降。

3.3 正交试验结果只有C因素有显著性差异。通过单因素考察结果发现，提取时间为3 h远高于2 h的多糖提取量，因此选择3 h为提取时间，其它因素宜采用工艺简单、成本低廉的原则进行选择。

3.4 实验采用单因素考察确定正交因素水平，建立正交实验方法，对柘木多糖的提取条件进行了优化。由单因素实验和正交分析结果得知，提取温度是主要影响因素，其次是提取溶媒的倍量;提取时间3 h内无显著差异。柘木总多糖的最佳提取工艺条件为:温度为90℃，时间为3 h，液料比为10∶1。该工艺条件简单，稳定可行，可用于柘木多糖的提取。

［1］江苏新医学院.中药大辞典(下册)［M］.上海:上海科学技术出版社，1998:1502.

［2］中国药典［S］.一部.1977:443-444.

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［4］丁红华，陈栋晖，朱莉菲，等.柘木糖浆治疗胃癌疗效观察［J］.中成药，2001，23(2):151-152.

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［6］盛小莉，王凯平.正交设计优化当归多糖提取工艺［J］.中成药，2005，30(12):1682-1684.

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