两个脯氨酸有机催化剂合成的正交优化和HPLC－MS/MS对其结构的鉴定

郑 敏，彭敬东，吴传隆，王 宁

（西南大学化学化工学院，重庆 400715）

近年来，高效液相色谱与串联质谱（HPLCMS/MS）联用已发展成为科研和日常分析中最有力的一种工具，在各种应用领域中都有广泛的应用[1]。随着新的电离方法，尤其是电喷雾电离源（ESI）的出现，HPLC－MS/MS法更牢牢确立了其在研究中的重要地位。电喷雾电离源的一级质谱中，分子离子峰丰度高，干扰小；电喷雾电离源的电离效率高，足以满足多级质谱离子或化合物断键的需要；同时，解析分子离子的同位素峰也可确定离子带电数和相对分子质量，可使质量分析器检测的质量提高几十倍甚至上百倍；加之ESI可以很方便地与液相色谱分离技术连接，通过调节液相分离条件和调整控制电压离子源，就能很容易地使得离子断裂，获取结构信息。将液相色谱的高分离特性和质谱的高灵敏度、高选择性结合，可以简化样品的前处理，提供未知样品的结构和质量数据，缩短分析时间[2－8]。同时，质谱的强定性能力不再因HPLC常用的检测手段——紫外或荧光检测器要求底物必须具备生色团而受到限制，HPLC－MS这一技术必将得到广泛的应用。

小分子的脯氨酸催化剂，现在仍然是很适用的有机催化剂[9－10]。无论在经济成本和简单实用方面，它都是其他很多有机催化剂无法比拟的。然而，未经修改的脯氨酸有一个致命的缺点，即自身缺乏疏水基团，同时还不含生色团，其催化合成的对应异构体多需要在非极性环境下生成。因为好的对映体的诱导很难或者不可能在水介质中发生[10，11－13]，因此无论是给脯氨酸键合上必要的疏水基，还是脯氨酸的脱保护过程，都是复杂、耗时的，鉴定也是很难进行的。本工作采用Kristensen等[10]建立的方法，直接通过CF3CO2H羟酰化这一步选择性的在脯氨酸的间位引入非极性基团，合成得到两个O－酰基衍生物盐酸盐结晶物。

已有许多文献报道了HPLC－MS/MS法的有价值的应用，科学家们对液质联用的兴致也提高了很多[14－15]。然而，目前却只有很少的研究报道了高效液相色谱－串联质谱在线监测反应的定性分析。本工作为了通过高效液相色谱－串联质谱的快速分离和高灵敏度、强定性的功能找到最佳的合成反应条件，通过正交水平因素法研究各条件对反应的影响强弱，以更好的控制反应。两个缺乏生色团的O－酰基－4－羟基脯氨酸盐酸盐有机催化剂在优化好的反应条件下进行合成。通过液质联用能有效地监控这两个O－酰基－反式－4－羟基脯氨酸盐酸盐有机催化剂的合成，并对产物进行鉴定，从而解释反应机理，拓展HPLC－MS的应用范围。

1 试验部分

1.1 主要仪器与装置

Agilent 1200高效液相色谱仪：美国Agilent公司产品，配有Agilent化学工作站系统软件；Bruker核磁共振仪（300M，NMR），Bruker Daltonics HCT质谱仪（配有Bruker工作站）：美国Bruker公司产品。

1.2 主要材料与试剂

O－4－羟基脯氨酸和酰氯（分析纯）：美国Sigma公司产品；CF3CO2H，乙醚和甲酸（分析纯）：成都科龙化工厂产品；乙腈和甲醇（色谱纯）：美国Scharlau化学试剂有限公司产品；CDCl3：青岛龙微波技术有限公司产品；水为去离子水；其他试剂均为分析纯或更高纯度。

1.3 脯氨酸有机催化剂的合成

将120mL CF3CO2H加入干燥洁净的500 mL圆底烧瓶中，并放在冰浴中。32.75g（250 mmol）粉状羟基脯氨酸在70～75℃下干燥24h后，缓慢加入反应瓶中，剧烈搅拌，形成粘性溶液（脯氨酸有小部分没有溶解）。混合物反应15 min后，从冰浴中取出，室温搅拌5min，将1.5倍摩尔比的酰氯缓慢加入反应瓶中，室温下继续搅拌6h，得到无色透明溶液[13，16－18]。吸取 100 μL反应液加入900μL乙腈稀释，取5μL反应稀释液通过高效液相自动进样，分离。对产物的相对分子质量和结构进行质谱测定。

将反应6h后的反应烧瓶放在冰浴中冷却，剧烈搅拌20min后，加入360mL乙醚，先缓慢、后加快速度。产生的白色悬浮液在0～5℃下搅拌15min后，减压过滤。乙醚润洗2次，通风橱内室温干燥23h，得到干燥的细白粉末状的O－酰基－4－羟基脯氨酸盐。经此方法洗涤的样品纯度较高，可直接进行核磁分析，反应机理示于图1。

图1 脯氨酸有机催化剂的反应机理Fig.1 The mechanism of the reaction

1.4 LC/MS条件

1.4.1 色谱条件 采用自动进样器进样；色谱柱：Gemini－C18柱（150×4.6mm×5mm）；进样量：5mL；柱温：30℃；流动相为V（乙腈）∶V（5mmol/L甲酸溶液）＝40∶60）的混合溶液；流速0.2mL/min；运行时间15min。

1.4.2 质谱条件 毛细管电压3 500V，喷雾器25MPa，干燥气体流速10L/min，干燥气体温度350℃，质谱扫描范围m/z 15～1 000。串联质谱参数列于表1。

表1 分析物串联质谱参数Table 1 Tandem mass spectrometry parameters for the targets

2 结果与讨论

2.1 通过正交试验优化脯氨酸有机催化剂的合成

为了找到合成脯氨酸有机催化剂的最佳条件，应用水平正交试验，这不仅可以研究独立变量对反应的影响，也可以确定每一个因素对反应影响的强弱关系[19－20]。

试验中，根据反应时间（A），底物摩尔比（B）和温度（C）3个因素对反应效率的影响，设定了3因素6水平的正交试验。在测定结果中，k是O－酰基－反式－4－羟基脯氨酸的分子离子峰面积的总和，结果列于表2。通过比较各水平的k值，可以确定反应的最佳条件。R＝max｛k1，k2，…，kn｝－min｛k1，k2，，…kn｝，R 代表各因素对反应的影响。高R值的变量，意味着这个变量对结果的影响更强，结果列于表3。

分析结果得到合成的最佳反应条件为A2B4C5，各因素对反应的强弱影响为：C＞B＞A。因此，将1.5倍摩尔比的酰氯加入反－4－羟基脯氨酸中，让它们在室温下反应6h，即为合成的最佳条件。

表2 正交试验因素表Table 2 Orthogonal factors

表3 正交试验数据处理与直观分析结果（n＝3）Table 3 Experimental arrangement and results of activity of reaction time，mole ratio of substrates and temperature（n＝3）

2.2 合成的脯氨酸有机催化剂分子的分子质量和结构测定

MS/MS是在分子质量和物质结构验证方面有用的工具之一。质谱作为结构的重要仪器，同时具备了准确、快速、灵敏的优点。O－酰基－4－羟基脯氨酸苯乙烯和O－酰基－4－羟基脯氨酸戊烷的结构分别示于图2，图3。二者的质谱图分别示于图4，图5。

M1（O－酰基－4－羟基脯氨酸苯乙烯）：

MS：＋MS：图3b中，283.5 [M＋Na]，261.5[M＋1]；

MS2：图3c中，243.3[M－H2O]，215.3[M－COOH]，130.5[M－O－酰基－4－羟基脯氨酸]＋。图3c中的碎片质量同图3d中断键部位的质量片段完全成一一对应关系。以上数据充分证明了图3a中1号出峰物即为O－酰基－4－羟基脯氨酸苯乙烯。

图2 O－酰基－4－羟基脯氨酸苯乙烯的结构图Fig.2 The structure of O－acyl－trans－4－hydroxy－proline hydrochloridel styrene

图3 O－酰基－4－羟基脯氨酸苯乙烯的质谱图Fig.3 MS of O－acyl－trans－4－hydroxy－proline hydrochloridel styrene

图4 O－酰基－4－羟基脯氨酸戊烷的结构图Fig.4 The structure of O－acyl－trans－4－hydroxy－proline hydrochloridel pentane

M2（O－酰基－4－羟基脯氨酸戊烷）：

MS：＋MS：251.5[M＋Na]，229.5[M＋1]；

MS2：183.5[M－COOH]，131.5[O－酰基－反式－4－羟基脯氨酸]＋。这些质谱数据亦能充分证明图5a中2号出峰物即为O－酰基－4－羟基脯氨酸戊烷。

脯氨酸有机催化剂在二级质谱中的断键过程示于图6。

图5 O－酰基－4－羟基脯氨酸戊烷的质谱图Fig.5 MS of O－acyl－trans－4－hydroxy－proline hydrochloridel pentane

为了使测定的结果更加可信，采用核磁共振法来验证实验中合成的材料结构。

O－酰基－4－羟基脯氨酸苯乙烯：

图6 脯氨酸有机催化剂在二级质谱中的断键过程Fig.6 The bond breaking process of proline organic catalyst in the secondary mass

O－酰基－4－羟基脯氨酸戊烷：

通过以上质谱谱图、数据同氢谱（1HNMR）以及碳谱（13C）提供的信息对比分析，表明试验所得的产品即为需要的脯氨酸有机催化剂。质谱分析结果也能充分证明物质的组成和结构，液质联用的结构分析准确、灵敏，方法快速、经济。

2.3 优化色谱分离

甲酸浓度对色谱分离有较大的影响。配制了一系列浓度分别为1、2、4、5、7、10mmol/L的甲酸溶液进行了研究。结果表现，当甲酸浓度为5mmol/L，可以实现最好的色谱分离。这种现象可以认为色谱分离的目标底物自身是一种弱酸性物质。此外，甲酸还可以增强底物在质谱中的电离能力，对试验是非常有帮助的。因此，试验采用5mmol/L甲酸水溶液作为流动相的水相。

3 结论

两个O－酰基－4－羟基脯氨酸有机催化剂在高效液相色谱－串联质谱法建立的正交试验优化条件下进行了合成。高效液相色谱法的快速高效分离，MS/MS对产物的相对分子质量和结构的高灵敏度和高选择性的检测鉴定，为实验研究节约了大量时间。正交试验试验了各因素对反应效率的影响，表明了各因素对反应影响强度的强弱，也为试验找到了最佳的反应条件：将1.5倍摩尔比的酰氯加入反－4－羟基脯氨酸中，在室温下反应6h。同时，高效液相色谱－串联质谱法能快速、准确地鉴定产物及其纯度，并对反应机理做进一步解释。该方法简便、易行，是一种省时、经济、有效的研究方法和分析手段，可用于有机反应监控和产物分析，也是高效液相色谱－串联质谱应用的拓展。

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