傣族药叶下珠提取物抗氧化活性研究

2011-01-29李乔丽戴建辉高云涛

中国医药指南 2011年16期

李乔丽戴建辉高云涛*

（1 云南民族大学化学与生物技术学院，云南昆明 650500；

2 民族药资源化学国家民委—教育部共建重点实验室，云南昆明 650500）

叶下珠[1,2]（Phyllanthus urinaria L.），又名珍珠草，为大戟科袖柑属植物全草，是云南各民族经常药用或食用的植物，是一种重要的傣族药，在傣族医学中，叶下珠称为“雅巴海”，主要用于清热解毒等。研究发现，叶下珠具有平肝清热、抗乙肝病毒和保肝作用[3]，以及利水解毒和明目等功效，主要活性成分为植物多酚，如没食子酸，短叶苏木酚酸和揉云实精等[4]，是一种具有较高药用价值的民族药材，值得进一步的研究。

本文研究了叶下珠乙醇提取物对超氧阴离子自由基清除活性、抑制脂质过氧化活性和红细胞的氧化损伤活性，为深入研究叶下珠的生物活性及开发利用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 实验材料、试剂及仪器

叶下珠样品（全株，干制，购自西双版纳傣医院），使用前粉碎至80目。

无水乙醇，硫酸亚铁，EDTA-Fe（Ⅱ）溶液：2.5mmol/L，0.1mol/L pH 7.4 PBS缓冲液，核黄素溶液：1.67×10-5mol/L，蛋氨酸溶液：0.01mol/L蛋氨酸，氯化硝基四氮唑兰（NBT）溶液：4.6×10-5mol/L，上述3种溶液均用pH=7.4的PBS缓冲液配制；卵磷脂溶液：6.7mg/mL，200mg卵磷脂冰浴震荡溶解于30mL 0.01mol/L pH 7.4 PBS缓冲液；邻苯三酚；2-硫代巴比妥酸（TBA）溶液：1%（W/V）；三氯乙酸（TCA）溶液：28%（W/V），临用前配制。

光照箱（自制，35cm×30cm×25cm，光源为纯稀土节能灯，灯功率45w），容积330×270×290cm，体积10.0L，频率40/60KHz，实验使用超声频率为60kHz，输出功率320W。萃取容器置于超声清洗器中部，RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），7200型可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）。

所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 提取物溶液的制备

取叶下珠样品100.0g，首先乙醚除去叶绿素和脂类，用500mL乙醚浸泡8h，超声提取20min，过滤，弃去滤液，滤渣风干后用70%乙醇按料液比1∶5浸泡8h，超声提取30min，重复提取3次，合并3次滤液，减压蒸除溶剂后得乙醇提取物浸膏。浸膏得率为原材料的11.2%，用25%乙醇配制不同浓度的取叶下珠提取物溶液供试验使用。

1.2.2 清除超氧阴离子自由基活性实验

超氧阴离子自由基采用光照核黄素方法[5]，取1.67×10- 5mol/L核黄素、0.01mol/L蛋氨酸，4.6×10-5mol/L氯化硝基四氮唑兰（NBT）溶液各2.0mL，混匀，加入不同浓度的叶下珠提取物溶液1.0mL，置于光照箱中光照反应30min，测定560 nm处吸光度（A样），同时测定缓冲溶液空白吸光度（A0），计算清除超氧阴离子自由基清除率：

1.2.3 抗脂质过氧化作用

采用文献[6]的方法，以卵磷脂脂质体模拟细胞双层磷脂膜，该方法利用Fenton反应生羟自由基，羟自由基进攻卵磷脂诱导丙二醛（MDA）类似物的产生，MDA与体系中的硫代巴比妥酸（TBA）反应产生有色物质，可用分光光度法测定MDA的量评估氧化，加入叶下珠提取物后，对MDA的生成有抑制作用，据此可评价叶下珠提取物对脂质过氧化的抑制活性。取1.0mL 3.4mg/mL卵磷脂液，加入PBS缓冲液（pH 7.4）1.0mL，不同浓度的叶下珠提取物溶液1.0 mL，混匀，随后加入2.5mmol/L EDTA-Fe（Ⅱ） 1.0mL，置于37℃水浴中，加热45min后加入28%（W/V）的TCA 2.0mL，1%（W/V）的TBA 1.0mL，于沸水浴中加热反应10min，取出迅速冷却，测定532nm处吸光度（A样），以PBS缓冲液为空白（A0）。按下式计算抑制率：

1.2.4 对红细胞的氧化损伤抑制作用

以文献报道的邻苯三酚-红细胞体系[7]为模型，利用邻苯三酚在碱性条件下自氧化放出超氧自由基，使红细胞膜中的类脂分子的不饱和键发生氧化，氧化损伤产物在λ=439nm处产生最大吸收，加入叶下珠提取物溶液后抑制氧化反应，导致吸光度A439nm降低，以此评价抑制作用。红细胞取自正常人静脉血，用等渗磷酸缓冲液配成10mL/L红细胞悬浮液。取1.0mL红细胞悬浮液，加入5.0mL 0.1mol/L pH 7.4 PBS缓冲液，加入不同浓度的叶下珠提取物溶液0.10mL，放置10min，使萃取物与红细胞悬浮液充分作用，加入0.10mL邻苯三酚溶液（50mmol/L）启动自由基氧化反应，反应10min后测定439nm处吸光度（A样品），同时测定空白样吸光度（A损伤）。

2 结果与讨论

2.1 对超氧自由的清除作用

对超氧自由的清除作用可以用清除率为50%时的萃取物浓度IC50和最大清除率ICmax表达，IC50越小、ICmax越大，表明萃取物对自由基的清除作用越强，研究选择抗氧化化活性较高的茶多酚为对照。叶下珠提取物对光照核黄素超氧自由基的清除作用见图1，从图可知，叶下珠提取物对超氧自由基具有较好的清除作用，并呈现剂量-效应关系，IC50值为0.0817mg/mL，茶多酚IC50值为0.0503mg/mL，说明叶下珠提取物抗氧化活性启动浓度高于茶多酚，但叶下珠提取物最大清除率ICmax（69.1%）却高于茶多酚（65.4%）。

图1 叶下珠提取物对超氧自由基的清除作用

2.2 对脂质过氧化抑制作用

对脂质过氧化抑制作用强弱可用抑制率同样可用50%时的浓度IC50和最大抑制率ICmax表示，并以茶多酚为对照，结果见图2。

从图2可知，叶下珠提取物对脂质过氧化具有较好的抑制作用，随着叶下珠提取物浓度增加，脂质过氧化抑制率也随之增加，但叶下珠提取物浓度增加到时抑制率达到最大，从图可知，叶下珠提取物的抑制作用略高于茶多酚，叶下珠提取物和茶多酚的IC50值分别为0.092mg/mL、0.1mg/mL，ICmax（69.1%）却高于茶多酚（65.4%），ICma值分别为65.8%，64.2%。

图2 叶下珠提取物对脂质过氧化的抑制作用

2.3 对红细胞的氧化损伤抑制作用

图3为邻苯三酚超氧自由基与红细胞作用的吸收光谱，体系1为红细胞（RBC）中加入邻苯三酚超氧自由基，吸光体系2、3、4、5、6分别为红细胞+邻苯三酚体系加入0.02、0.05、0.10、0.15、0.20mg/mL叶下珠提取物，体系7为红细胞悬浮液，从图可知红细胞悬浮液在整个测定波长范围内基本无吸收，加入邻苯三酚超氧自由基后，在439nm处出现一个明显的吸收峰，表明超氧自由基对红细胞产生明显损伤，加入叶下珠提取物后，439nm处吸收峰随着提取物浓度增加而逐渐下降，表明叶下珠提取物对红细胞的氧化损伤具有良好的抑制作用，且呈现剂量-效应关系。