壳聚糖对饲料镉致罗非鱼急性毒性的影响

刘淑兰 翟少伟 佘欢欢 贾景涛 宋 凯

壳聚糖对饲料镉致罗非鱼急性毒性的影响

刘淑兰 翟少伟 佘欢欢 贾景涛 宋 凯

通过两个试验研究了壳聚糖对饲料中镉致罗非鱼急性毒性的影响。试验1将360尾罗非鱼随机分为两个处理（对照组和试验组），每个处理3个重复，比较壳聚糖添加后饲料镉致罗非鱼96 h半致死剂量的变化情况。对照组一次性投喂镉水平分别为0.00%、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%和2.00%的6种对照饲料；试验组饲料镉含量与对照组相同，并加入10%壳聚糖，同法进行饲料镉对罗非鱼的急性毒性试验。试验2将160尾罗非鱼随机分为两个处理，每个处理4个重复，分别投喂镉含量为0.50%的对照组和试验组饲料，研究饲料中添加壳聚糖对镉致罗非鱼半致死时间的影响。试验结果为：两个试验中试验组鱼的死亡率均低于对照组；对照组96 h半致死剂量（LD50）和半致死时间（LT50）分别为（49.67±6.11）mg/kg·BW 和（47.76±3.03）h，试验组 96 h LD50和 LT50分别为（86.05±6.11）mg/kg·BW和（65.20±6.09）h，试验组 96 h LD50和 LT50与对照组相比差异极显著（P＜0.01），表明壳聚糖能够缓解饲料中镉对罗非鱼的急性毒性。

壳聚糖；饲料镉；罗非鱼；急性毒性

重金属作为一种持久性生物体污染物，已受到世界范围内人们的广泛关注。水产品重金属污染是一个比较普遍的食品安全问题，镉的残留是其重点监测项目之一（郑宗林等，2003）。镉是机体生长发育的非必需元素，对人和动物健康具有严重危害，可造成鱼体多种组织器官损伤，进而干扰鱼体各种生理功能（Gomot等，1998；Lam 等，1998；孙德文等，2003）。饲料是鱼体中镉的主要来源之一，饲料中的镉主要来源于饲料原料（如鱼粉、矿物质添加剂等）以及加工过程（王丹红等，2004）。目前，开发饲料重金属吸附剂是减轻饲料镉对水产动物危害的重要途径。

壳聚糖是几丁质经过脱乙酰作用得到的产物。目前已广泛用作一种水产和畜牧业饲料添加剂，用于增强机体免疫力、抑制病菌生长以及促进动物生长等方面（郑宗林等，2004）。在水处理方面，壳聚糖是一种良好的重金属离子吸附剂，其对Cd2+吸附率可达95%（代淑娟等，2007）。目前利用壳聚糖吸附水环境中的重金属离子已成为一个研究热点（陈亮等，2001；丁纯梅等,2007），而壳聚糖作为饲料添加剂能否在鱼体肠道环境中吸附来源于饲料中的镉，进而缓解镉对鱼类的毒性作用还未见报道。本研究以罗非鱼为试验动物，探讨饲料中壳聚糖对镉致罗非鱼急性毒性的影响，为壳聚糖在鱼类养殖中的进一步应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物及试验设计

试验用鱼为吉富罗非鱼，购于厦门市杏林诚毅水产公司。

试验1：经多次预试验，初步确定饲料镉致罗非鱼24 h最高无死亡剂量和最低绝对致死剂量。将360尾健康无病，平均体重为（2.03±0.12）g/尾，平均体长为（4.39±0.15）cm/尾的罗非鱼随机分为两个处理，即对照组和试验组，每个处理3个重复，每个重复60尾，每缸随机放入试验鱼10尾。

试验2：将160尾健康无病，平均体重为（2.73±0.29）g/尾，平均体长为（4.55±0.53）cm/尾的试验鱼随机分为两个处理组（对照组和试验组），每组4个重复，每个重复20尾。对照组投喂镉水平为0.5%的饲料，试验组投喂镉水平与对照组相同且添加10%壳聚糖的饲料，投喂方法与试验1相同。

1.2 试验饲料

基础饲料配方见表1。

对照组饲料在基础饲料中添加10%微结晶纤维素和不同含量氯化镉，配制成镉含量分别为0.00%、0.10%、0.25%、0.50%、1.00%和 2.00%的对照饲料；试验组饲料在对照组饲料的基础上，用10%壳聚糖等量替换结晶纤维素，饲料镉水平与对照组相同。

表1 基础饲料配方

壳聚糖购于山东奥康生物科技有限公司，食品级，脱乙酰度≥90%，分子量约为3×105。

1.3 饲养管理

罗非鱼在220 cm×80 cm×100 cm的养殖水箱中暂养 2周，持续充氧，水温 28～32 ℃，pH 值 6.4～7.5，溶解氧 5～8 mg/l。每日投喂 3次（8:00、13:00和 18:00）基础饲料，日投喂量为鱼体重的6%。每天定时吸污、换水，换水量为100%。暂养期间，罗非鱼健康无病，日平均死亡率为0.01%。

1.4 试验条件

试验用水为充分曝气自来水,水温为28～30℃，pH 值 6.4～7.5，溶解氧 5～8 mg/l，硬度约 2.2 度（德国度）。试验在30 cm×26 cm×22 cm的玻璃缸中进行，每缸加入10 L曝气自来水。

1.5 试验步骤

试验1初始，各处理组饱食投喂一次，30 min后捞取每缸剩余饲料，烘干并称重，计算各组平均每千克体重镉的摄食量。试验前24 h停止投喂，试验期间不投喂。每天观察并记录各处理组试验鱼中毒症状和死亡情况，连续记录96 h。试验2投喂方法与试验1相同，每12 h记录各处理组死亡情况,连续记录96 h。

1.6 评价指标

死亡率 （%）=100×（初始鱼尾数-终末鱼尾数）/初始鱼尾数。

半致死剂量是使受试罗非鱼半数死亡的饲料镉剂量，用LD50表示。

半致死时间是使受试罗非鱼半数死亡的时间，用LT50表示。

根据米静洁等（2008）的计算方法，利用试验期间死亡鱼数及死亡时间，采用概率单位体重-剂量对数直线回归法和概率单位-时间对数直线回归法计算96 h半致死剂量LD50和半致死时间LT50。

1.7 统计分析

采用Excel软件进行数据整理，结果用平均值±标准误差表示。利用SPSS11.0软件的Probit模块计算半致死剂量及半致死时间，One-Way ANOVA法进行方差分析（P＜0.05表示均数间差异显著，P＜0.01表示均数间差异极显著）。

2 结果

2.1 试验鱼中毒症状

投喂试验饲料后，试验鱼在24 h内游动如常。30 h后高剂量组出现异常反应，中毒鱼表现为狂游、跳跃、易受惊吓、呼吸速度明显加快，体色变黑；随后游动缓慢，反应迟钝，逐渐丧失运动能力而静止在底部，最后死亡。低剂量组试验鱼出现中毒症状需要时间较长，中毒症状与高剂量组基本相同。死亡鱼鳃部水肿，呈紫红色，鳃盖周围及腹部点状出血。

2.2 壳聚糖对饲料镉致罗非鱼死亡率及半致死剂量的影响

壳聚糖对饲料镉致罗非鱼的96 h死亡率及半致死剂量（LD50）的影响见图1和图2。试验组鱼的死亡率在96 h内均低于对照组，或与之相同，两者呈现出低剂量组和高剂量组差异小，而中剂量组差异显著的趋势；投喂镉含量为0.25%的试验组96 h死亡率极显著低于对照组（P＜0.01），投喂镉含量为0.5%的试验组96 h死亡率显著低于对照组（P＜0.05），其他镉水平组间的死亡率差异不显著（P＞0.05）。对照组镉致罗非鱼的 96 h半致死剂量（LD50）为（49.67±6.11）mg/kg BW，试验组96 h LD50为（86.05±6.11）mg/kg BW，试验组 96 h LD50极显著高于对照组（P＜0.01）。

图1 壳聚糖对饲料镉致罗非鱼96 h死亡率的影响

图2 壳聚糖对饲料镉致罗非鱼96 h LD50的影响

2.3 壳聚糖对饲料镉致罗非鱼死亡率及半致死时间的影响

壳聚糖对饲料镉致罗非鱼的死亡率变化和半致死时间（LT50）的影响见图3和图4。试验组罗非鱼的死亡率在96 h内均低于对照组，尤其在36 h和48 h时两组差异极显著（P＜0.01），60 h时两组差异显著（P＜0.05），其他时间点差异不显著（P＞0.05）。对照组镉致罗非鱼的LT50为（47.76±3.03）h（95%置信区间为42.94～52.99 h），试验组 LT50为（65.20±6.09）h（95%置信区间为55.51～74.89 h）,试验组镉致罗非鱼的半致死时间极显著高于对照组（P＜0.01）。

图3 壳聚糖对饲料镉致罗非鱼96 h死亡率的影响

图4 壳聚糖对饲料镉致罗非鱼LT50的影响

3 讨论

试验中罗非鱼的中毒症状与其他学者观察到的镉对鱼类的急性中毒症状相似（翟毓秀等，2005；Witeska等，2006）。中毒初期，鱼表现出跳跃、冲撞、上下翻滚、快速游动等行为；中毒后期表现为乏力，失去平衡，下沉死亡。鱼类重金属中毒时，鳃部会分泌大量黏液，形成絮状沉积物，使鱼鳃阻塞，引起呼吸障碍，浮游于水表层。该试验与其他学者（陈贵良等，2004）观察到部分罗非鱼镉中毒后，其体色也逐渐呈现黑色等现象相一致。

研究中，试验组的死亡率总体上低于对照组，96 h LD50和LT50均显著高于对照组，表明壳聚糖通过吸附作用可能降低了肠道中游离态镉的含量，从而缓解了镉对罗非鱼的毒性。Ren等（2006）的研究表明，饲料中添加3%水溶性壳聚糖可以降低虹鳟鱼肝脏、肾脏以及肌肉对饲料镉的累积。试验中所用壳聚糖为高分子量壳聚糖，它能够显著影响镉对罗非鱼的毒性，这种差异可能与试验动物种类及其体内存在的壳聚糖降解相关酶的活性有关。

壳聚糖分子链中存在大量带孤对电子的活性基团（-NH2和-OH）。研究表明，-NH2是壳聚糖吸附镉的活性基团，-OH不参与吸附反应。吸附的过程中存在着化学吸附和物理吸附两种形式，在化学吸附中，2个氨基与1个Cd2+通过电价配键形成稳定的电价络合物（王志华等，2001；李建勇，2004），从而降低重金属镉离子的毒性。壳聚糖体外吸附Cd2+的最佳pH值为 6.0～8.0（代淑娟等，2007；丁纯梅等，2007），而罗非鱼肠道内 pH 值范围是 7.2～8.3（Maier等，1984）。因此两者的结合态在鱼肠道内可以稳定存在；壳聚糖还能够优先与镉结合并将其带出体外（孙继鹏等，2010），从而减少鱼体对重金属镉的吸收。随粪便排出体外的壳聚糖与镉络合物，在水环境中可稳定存在，不会继续对鱼体产生毒害作用（李秋明，2010）。

4 结论

试验表明，壳聚糖能够吸附罗非鱼肠道环境中的镉，降低肠道中游离态镉的浓度，减少鱼体对Cd2+的吸收，从而降低其死亡率，使镉致罗非鱼的半致死剂量和半致死时间显著增加（P＜0.01），说明壳聚糖可以缓解饲料镉对罗非鱼的急性毒性作用。

[1] 郑宗林,黄朝芳,廖三赛.重金属对鱼类的危害及污染防治[J].中国饲料,2003（15）:23-24.

[2] 朱文慧,步营,于玲,等.国内外水产品中重金属限量标准研究[J].齐鲁渔业,2010,27（3）:49-51.

[3] Gomot A.Toxic effects of cadmium on reproduction,development and hatching in the freshwater snail Lymnea stagnalis for water quality monitoring[J].Ecotoxicology and Environmental Safety,1998,41:288-297.

[4] Lam K L,Po Wai Ko,Wong Judy Ka-Yee,et al.Metal toxicity and metallo-thionein gene expression studies in common carp and tilapia[J].Marine Environmental Research,1998,46（1-5）:563-566.

[5] 孙德文,詹勇,许梓荣.重金属对鱼类危害作用的研究 [J].水利渔业,2003,23（2）:4-6.

[6] 王丹红,蔡春平,吴文,等.进口鱼粉中重金属的监测与风险分析[J].检验检疫科学,2004,14（6）:32-33.

[7] 郑宗林,唐俊,喻文娟.壳聚糖在水产养殖中的应用及前景展望[J].渔业现代化,2004（5）:40-42.

[8] 代淑娟,马文学,王玉娟,等.壳聚糖吸附电镀水中镉的研究[J].有色矿冶,2007,23（6）:42-45.

[9] 陈亮,陈东辉,李步祥.壳聚糖吸附处理废水的研究进展 [J].四川环境,2001,20（3）:19-23.

[10] 丁纯梅,苏云,章筱婷,等.壳聚糖及壳聚糖膜对水中镉的吸附性能的研究[J].环境与健康杂志,2007,24（6）:393-395.

[11] 米静洁,袁慧,王兰.铜镉铬铅对河南华溪蟹的急性毒性作用[J].安徽农业科学,2008,36（17）:7273-7274,7321.

[12] 翟毓秀,杨学宋,宁劲松,等.镉在大菱鲆体内蓄积规律及对生长和食品安全影响初探[J].海洋水产研究,2005,26（4）:26-31.

[13]Witeska M,Jezierska B,Wolnicki J.Respiratory and hematological response of tench,Tinca tinca （L.）to a short-term cadmium exposure[J].Aquaculture International,2006,14（01）:141-152.

[14] 陈贵良,姚林,张艳淑.镉对鲫鱼主要脏器中锌、铜含量的影响[J].环境与职业医学,2004,21（4）:332-333.

[15] Ren H,Jia H,Kim S,et al.Effect of Chinese parsley Coriandrum sativum and chitosan on inhibiting the accumulation of cadmium in cultured rainbow trout Oncorhynchus mykiss[J].Fisheries Science,2006（72）:263-269.

[16] 戴芸,朱旭芬.微生物壳聚糖酶的研究概况 [J].浙江大学学报（农业与生命科学版）,2004,30（2）:229-236.

[17] 王志华,王书俊,黄毓礼.X射线光电子光谱法研究壳聚糖吸附镉（Ⅱ）的机理[J].分析试验室,2001,20（6）:14-16.

[18] 李建勇.壳聚糖对水中重金属离子的吸附特性 [J].辽宁城乡环境科技,2004,24（6）:16-23.

[19] 孙继鹏,汪东风,李国云,等.壳寡糖钙、镁配合物对栉孔扇贝体内镉的脱除[J].中国海洋大学学报,2010,4（2）:33-37.

[20] Maier K J,Tullis R E.The effects of diet and digestive cycle on the gastrointestinal tract pH values in the goldfish,Carassius auratus L.,Mozambique tilapia,Oreochromis mossambicus（Peters）,and channel catfish,Ictalurus punctatus（Rafinesque）[J].Journal of Fish Biology,1984,25（2）:151-165.

[21] 李秋明.壳聚糖对镉致罗非鱼急性毒性影响的初步研究 [D].集美大学本科学位论文,2010:1-8.

The effect of chitosan on the acute toxicity of dietary cadmium to tilapia

Liu Shulan,Zhai Shaowei,She Huanhuan,Jia Jingtao,Song Kai

Two experiments were conducted to evaluate the effect of chitosan on the acute toxicity induced by dietary cadmium to Tilapia.The effects of chitosan in diet on the mortality rate and the 96 h median lethal dose （LD50）were studied in the first experiment.360 Tilapa were randomly divided into two treatment groups （the control group and the experimental group）with three replicates in each treatment and 60 fish per replicate.Tilapia of the control group was exposed to dietary Cd at concentrations of 0.00%,0.10%,0.25%,0.50%,1.00%and 2.00%.The dietary Cd level of the experimental group with 10 percent of chitosan was the same as the control group.160 Tilapa were used to investigate the effect of chitosan in diet on the half lethal time （LT50）in the second experiment.The fish was randomly divided into two treatment groups（the control group and the experimental group）with four replicates in each treatment and 20 fish per replicates.The control group was fed with the diet containing 0.50%cadmium,and the treatment group was fed with the corresponding experimental diet containing 0.50%cadmium and 10%chitosan.The results showed that the mortality rates of the experimental group in the two experiments were lower than those of the control group.The 96 h LD50and LT50of the control group were （49.67±6.11）mg/kg （body weight）and （47.76±3.03）hours,respectively.While the experimental group were （86.05±6.11）mg/kg （body weight）and （65.20±6.09）hours,respectively.The significant differences were found between 96 h LD50and LT50of the control group and those of experimental groups （P＜0.01）.The results in present study suggested that chitosan could decrease the toxicity of dietary cadmium to tilapia.

chitosan；dietary cadmium；tilapia；acute toxicity

项目来源：福建省教育厅科技项目[JA10190]；福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室开放基金[2009J301]；集美大学优秀青年骨干教师基金[2008C002]资助

S965.125

A

1001-991X（2011）10-0042-04

刘淑兰，集美大学水产学院，福建省高校水产科学技术与食品安全重点实验室，361021，福建省厦门市印斗路43号。

翟少伟（通讯作者）、佘欢欢、贾景涛、宋凯，单位及通讯地址同第一作者。

2011-01-05

（编辑：沈桂宇，guiyush@126.com）