胆管纳米银涂层抗菌塑料支架的研制

【作 者】杨杰，令狐恩强，王银川

1 解放军总医院消化疾病中心 ，北京 ，100853

2 北京大学化学与分子工程学院，北京，100871

银，作为传统的抗菌材料，在古代就被广泛用于抗菌、防腐,具有强大的抑菌、杀菌作用及广谱的抗菌活性。纳米银作为金属银的一种特殊形态,是指粒径在1-100 nm之间的金属银微粒组成的粉体。由于纳米银颗粒极其微小,表面积较大,使其具有显著的表面效应、量子尺寸效应和量子隧道效应, 因而具有与传统无机抗菌剂无法比拟的抗菌效果,且安全性高、效力持久[1-2]。纳米银粉可装载于活性碳纤维、纺织品、涂料等产品中，制备出具有抗菌功能的产品。在在卫生、保健、医学领域也得到广泛应用[3-5]。

胆管塑料支架可更换且价格便宜, 适用于良性狭窄及胆漏治疗。但胆管支架置入胆管后，支架的末端位于十二指肠腔内，oddis括约肌失去功能，胆管压力降低使十二指肠内容物返流，十二指肠腔内的细菌返流进入胆管，潜在增加胆系感染及引起支架阻塞[6]。使用目前材料制作的支架及附件均无抗菌作用。胆管纳米银涂层塑料支架的应用未见相关报道。

1 胆管塑料支架纳米银涂层制备原理及步骤

以直径8.5 Fr，长5 cm国产普通聚四氟乙烯材料制成的塑料胆管支架为载体，采用化学氧化还原法，利用超声波振荡及磁力搅拌等方法，以硝酸银为原料，将纳米银颗粒还原并沉积在载体材料表面，使支架内外表面均匀附着纳米银颗粒。纳米银涂层支架制作流程如图1所示。

图 1 镀纳米银工艺流程Fig. 1 Technological process of nano-silver plating

(1) 除油

将胆管聚四氟乙烯支架浸于无水乙醇中振荡超声清洗。

(2) 粗化（还原）

粗化液配制：将一定量的金属钠加入到四氢呋喃与萘的溶液。磁力搅拌器室温下搅拌，直至溶液颜色呈现深褐色或黑色。

金属钠为强还原剂，空气中易燃烧。因此以萘为分散剂，通过磁力搅拌器搅拌将钠均匀溶于有机溶剂四氢呋喃中, 将除油后塑料支架放入粗化液中腐蚀(通过还原法)粗化4小时，目的是除去支架表面的部分氟原子，在表面形成部分碳化层和某些极性基团。

(3) 清洗

首先，用二次去离子水充分清洗，以除去支架表面吸附的钠和大部分萘、四氢呋喃（2Na+H2O→2NaOH+H2↑）；然后，用乙醇浸泡超声清洗支架进一步除去多余的萘、四氢呋喃。

(4) 粗化（氧化）

将清洗后的塑料支架室温下放入稀硝酸溶液中进行氧化。稀硝酸为强氧化剂，使支架表面引入羟基、羰基和不饱和键等极性基团，这些基团能使表面能增大，接触角变小，润湿性提高，由憎水性变为亲水性，并在其表面形成适当的粗糙度，以保证银沉积层具有良好的附着力。一般来说，温度高，粗化效果好。但温度过高，塑料制品容易变形，所以，粗化温度要受到塑料制品热变形温度的限制。

(5) 清洗

二次去离子水充分清洗胆管塑料支架。

(6) 敏化

敏化液配制：取适量SnCl2.2H20及Sn粒加入二次去离子水配成SnCl2水溶液。将清洗后胆管塑料支架迅速放入敏化液中。目的是支架表面吸附有还原剂Sn2+。因为+2价Sn不稳定，有明显的还原性。Sn+2在空气中也容易被氧化为Sn4+。

(7) 镀银（活化）

将敏化后胆管塑料支架迅速浸入银氨水（缓冲）溶液（氨水+AgNO3水溶液）的活化液中，恒温水浴锅中保温。发生如下反应：Sn+2++2Ag+=Sn+4+2Ag↓，还原剂Sn+2将金属银还原成金属，吸附于制品表面形成纳米银涂层。胆管支架内外壁均匀附着纳米银，呈黑色见图2。

(8) 清洗

将沉积纳米银涂层后的胆管支架用二次去离子水充分清洗。镀纳米银前后的聚四氟乙烯支架如图2所示。

图2 胆管支架Fig.2 Biliary tract prosthesis

2 纳米银涂层与性能检测

2.1 透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy TEM H-9000型 日本日立公司）观察制备的纳米银涂层颗粒大小为5-80nm，见图3。

图3 制备纳米银纳米颗粒Fig.3 Nanoparticle of preparative nano-silver

2.2 通过扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscopy STM IIIA美国DI公司）观察，在银氨溶液浓度一定时，纳米银银涂层厚度随银氨溶液用量增加而增加。30 ml银氨溶液制得纳米银涂层厚约1 μm；60 ml银氨制得纳米银涂层厚约5 μm，见图4。

图4 不同厚度纳米银涂层Fig.4 Nano-silver coating of different thickness

2.3 X射线能谱分析(Energy Dispersive X-ray analysis，EDXA)

利用TEM所带X射线能谱仪检测聚四氟乙烯塑料胆管支架纳米银涂层各元素的含量及其分布情况（见图5）。结果发现，纳米银涂层中仅含有Ag，未含有其他成分。至于Al的小峰，能谱仪探头上的铝所致，铜峰是样品置于铜网检测所致。

2.4 摩擦系数检测

摩擦系数是指两表面间的摩擦力和作用在其表面上的垂直力之比值。它只跟材料、接触面粗糙程度有关，跟接触面积无关。滑动摩擦系数μ：μ= f /N，N为正压力，f为滑动摩擦力。支架表面光滑程度决定了表面沉积的物质数量最少。因此支架摩擦系数大小决定了支架内腔堵塞的程度。

利用扫描隧道显微镜（STM）测定胆管聚四氟乙烯塑料支架及沉积不同厚度纳米银涂层后的胆管塑料支架的摩擦系数（见表1）。

图5 纳米银涂层化学成分Fig.5 chemical composition of nano-silver coating

表1 胆管聚四氟乙烯支架及不同厚度纳米银涂层支架摩擦系数Tab.1 The friction coef fi cient of te fl on stent and stent with Nano-silver coating of different thickness

从表1可以看出，5 μm厚纳米银涂层塑料支架摩擦系数最小。所以，涂银纳米涂层后胆道支架的插入性能有了改善，同时不容易堵塞。

2.5 弹性系数检测

杨氏模量(Young’s Modulus)：是沿纵向的弹性模量(Elastic Modulus)，也是材料力学中的名词，是弹性材料的一种最重要、最具特征的力学性质，是物体变形难易程度的表征。杨氏模量大小决定了支架的顺应性、安全性。

杨氏模量取决于材料的组成。杨氏模量越大，该材料的刚性越大，反之，杨氏模量越小，该材料的弹性越大

利用扫描隧道显微镜(STM)测定胆管聚四氟乙烯塑料支架及沉积不同厚度纳米银涂层后的胆管塑料支架的弹性系数及支架表面微观形貌，支架表面凹凸不平的程度(高度)，见表2。

从表2可以看出，，随着银层厚度增加，杨氏模量最大峰值有增大趋势，但主峰值变化并不大，说明弹性系数无巨大变化；随着涂层厚度增加，支架表面凹凸不平程度差异变小，说明沉积纳米银涂层后支架表面更为平整，与摩擦系数检测结果具有一致性。

2.6 抗菌试验

表2 胆管聚四氟乙烯支架及不同厚度纳米银涂层支架弹性系数Tab.2 The elastic modulus of te fl on stent and stent with Nano-silver coating of different thickness

应用标准大肠杆菌菌株进行定性抑菌试验，用无菌棉拭子蘸取108CFU/ml菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个MH培养基表面，反复3次，每次将平板旋转60度，无菌条件下将长0.5 cm无菌胆管支架剖开，平分为2等分，无菌镊子随机挑取1片紧贴在平板中间，置于37℃恒温培养箱培养18小时，实验重复3次。纳米银涂层可见直径达6.5±0.74 mm抑菌圈。

图6 抑菌圈实验Fig.6 Inhibition zone test

3 动物试验

健康巴马小型猪10只健用于研究。实验用胆管支架环氧乙烷熏蒸独立包装。实验动物按体重随机分为2组.即普通胆管聚四氟乙烯支架组（n=5，普通支架组)；胆管纳米银涂层聚四氟乙烯支架组(n=5，纳米银支架组)。全麻成功后，腹腔镜监视下，分离并完全游离胆囊管及胆囊动脉，电凝切断胆囊动脉 ，距胆囊管根部0.5-1.0 cm处锐性剪断胆囊管,建立胆漏动物模型。胆漏造模术后(30分钟-1小时)行内镜逆行胆管造影（ERC）及胆管塑料支架置入。术后20天处死存活动物，取出胆管支架，扫描电镜（SEM）观察支架内表面菌斑情况。纳米银支架组见细菌散在分布，其间可见纤维样物质交联，细菌堆积稀疏，相对疏松。SEM低倍观察支架表面可见膜状物附着。普通支架表面可见大量细菌粘附，细菌相互交织堆积成团，细菌数量及堆积厚度明显增加。低倍观察可见支架表面粗糙，膜状物附着明显。

4 讨论

本研究通过化学还原法，以聚四氟乙烯塑料胆管支架为载体，经过除油、化学粗化、敏化、活化、镀银等过程，使Ag+ 还原为Ag原子，并生长为纳米银颗粒均匀附着于支架内外壁。

银作为一种广谱抗菌材料，不仅抑菌也能杀菌，而且细菌对银离子不产生耐药[7]。纳米技术的出现，更是大大增强了银的杀菌抗毒效力[8]。纳米是一个长度单位，纳米材料(nano materia1)又称为超微颗粒材料，具有表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应。纳米银成黑色而不是呈银的银白色，就是因为随着银颗粒的减小，出现了质子振动和能级不连续等特点，光的吸收、发射和散射发生变化而造成的。而且纳米颗粒越小，颜色越深。

纳米银可发挥其表面效应，增加金属银与细菌接触的机会，通常在低浓度下即可显示出抗菌效能，而且其抗菌性与纳米粒子的总表面积有关[9]，粒径越小，杀菌效果越好[10]。

纳米银在医药上的应用成为近年来研究的热点，新型的纳银米抗菌纤维、纳米银敷料、纳米银骨水泥、纳米银凝胶、纳米银妇科产品等不断地被开发出来[11-14]。但纳米银抗菌涂层胆管支架应用国内外未见相关报道。本实验通过定性抗菌实验及动物试验，说明制备纳米银胆管支架体内外均明显具有抑菌、抗菌作用。

在粗化剂的选择上我们先后试用浓硫酸，但由于氧化性太强，塑料胆管支架变型严重，故放弃；试用高锰酸钾MnKO4进行氧化(粗化)后，再用SnCl2进行敏化，还原银氨水缓冲溶液（氨水+AgNO3水溶液）中的Ag+，银沉积效果较好 ，但考虑到锰的毒性，放弃使用高锰酸钾；稀硝酸的氧化性比较温和，同时活化液中的硝酸银本身就有硝酸根离子，所以最终选择使用稀硝酸作为粗化剂（氧化剂）。

将敏化后胆管塑料支架置入银氨水（缓冲液）（氨水+AgNO3水溶液）中，可发生如下反应：Sn2++2Ag+=Sn4++2Ag↓。氨水（NH3● H2O）为缓冲溶液，具有弱碱性。胆汁为弱碱性液体，因此，在弱碱性环境中制备纳米银涂层置入胆管后性能稳定。

通过EDXA发现，本研究所制备纳米银涂层仅含有Ag，未含有其他化学成分，达到无毒标准，适用于动物体内。

杨氏模量(Young’s Modulus)：是沿纵向的弹性模量(Elastic Modulus)，是弹性材料的一种最重要、最具特征的力学性质，是物体变形难易程度的表征。应用扫描隧道显微镜(TEM)检测原始胆管塑料支架及沉积纳米银涂层后的胆管塑料支架杨氏模量(见表2)发现：随着银层厚度增加，杨氏模量最大峰值有增大趋势，但主峰值变化并不大；大体观察发现，在外力作用下支架弯曲度变大，当外力去除后，纳米银涂层支架可完全恢复原来形状。这种可恢复的变形称为弹性变形。说明改性后支架弹性无明显变化。

Coene[15]等对不同材料的支架做了广泛的研究，认为支架材料摩擦系数越低，支架发生堵塞的机率就越小。本实验，我们使用TEM检测胆管聚四氟乙烯支架及沉积纳米银涂层后的胆管塑料支架摩擦系数发现，沉积纳米银涂层后胆管塑料支架摩擦系数均较原始胆管塑料支架摩擦系数有变小趋势(见表1)。提示沉积纳米银涂层后支架表面更为光滑。

图7 支架表面菌斑Fig.7 Bacterial plaque on the surface of stent

5 结论

(1) 通过化学氧化还原法，以胆管塑料支架为载体，钠、稀硝酸为粗化剂，四氢呋喃为溶剂，萘为分散剂，SnCl2●2H20为还原剂，硝酸银为原料，氨水（NH3●H2O）为缓冲溶液，在弱碱性环境中成功制备在胆汁中可稳定释放的，支架内外壁均均匀附着纳米银颗粒的无毒纳米银涂层塑料胆管支架。

(2) 制备纳米银涂层纳米颗粒分布均匀，纯度高：纳米颗粒大小约5-80 nm，纳米银涂层仅含有Ag；

(3) 制备胆管纳米银涂层抗菌塑料支架表面光滑，弹性较原始支架无明显变化。在体内外具有较强抑菌、抗菌作用。

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