牛、梅花鹿和山羊X、Y精子头部面积差异分析

宫昌海 ，王惠娥 ，高庆华 ，唐继伟

（1.新疆巴州畜牧工作站，库尔勒 841000；2.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300）

牛、梅花鹿和山羊X、Y精子头部面积差异分析

宫昌海1，王惠娥2，3，高庆华2，3，唐继伟3

（1.新疆巴州畜牧工作站，库尔勒 841000；2.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；3.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，阿拉尔 843300）

用流式细胞仪分选有正常繁殖力的公牛（n=3）、公鹿（n=3）、公山羊（n=1）的精液，获得高纯度（≥91%）X和Y细管冷冻精液，对解冻后的X和Y精子进行常规染色制片，采用Motic Images Advanced 3.2软件自动测量X精子和Y精子头部面积。结果显示，公牛X精子的头部面积35.84 μm2±4.12 μm2，极显著高于Y精子（34.81 μm2±3.72 μm2）（P＜0.01）；梅花鹿 X 精子的头部面积 33.29 μm2±2.93 μm2，极显著高于 Y 精子（32.90 μm2±3.25 μm2）（P＜0.01）；山羊 X 精子的头部面积 28.53 μm2±3.16 μm2，也极显著高于 Y 精子（28.07 μm2±3.19 μm2）（P＜0.01）；不同分选纯度的公牛精液X精子之间、Y精子之间头部面积差异均不显著（P＞0.05）。结论：牛、梅花鹿、山羊X精子头部面积均极显著高于Y精子。

牛；公梅花鹿；公山羊；精子；流式细胞仪；头部面积

哺乳动物X、Y精子的差别是X、Y精子分离的基础，根据两性精子DNA含量的差异流式分选是当前的主流技术，且这个技术的正确性在牛上已经被大量生产预知性别的后代所证明［1-3］。流式细胞检索仪可以高速分离精子，但需要对精子细胞核染色和强激光照射，会对精子DNA产生一定损伤［4-5］，尽管有牛分离精子的正常后代可以继续正常繁殖下一代的报道［6-8］，但还是不能得出该技术是完全安全的评价。若这个技术应用到人类，安全性将是主要的限制，毕竟此项技术用于动物生产还不到20年。而人类医学实践中多应用X、Y精子的比重差异，通过密度梯度离心分离有限纯度的两性精子［9-11］。精子头部外形差异是一个重要特征，除了啮齿类等一些哺乳动物的精子头部呈圆形或三角形，大部分哺乳动物有一个扁平、卵形的头部，同卵子相比，哺乳动物精子细胞小得多，头部长度仅为 5～10 μm［12］。流式细胞仪获得的两个主信号——前向散射光（forward，FSC）和侧向散射光（side scatter，SSC），也可以用来分析细胞的大小和体积，并且Beckman Coulter公司的Quanta SC已在流式细胞分析系统中引入EV（电子体积）参数，能测量细胞大小，基于面积差异的分选更为简单和安全，而X、Y精子头部面积的可测量差异是研发这种分选技术的基础。

1 材料和方法

天津XY公司有正常繁殖力的171号、176号、203号种公牛；山羊：西北农林科技大学萨能原种羊场11号公羊；梅花鹿：吉林农业大学种鹿场131号、136号和天津六中药鹿场0号公鹿。

1.1 药品及器械设备 生理盐水；伊红Y染液（KH2PO4，6.64 g；Na2HPO4，2.56 g；伊红 Y4.0g、苯酚 50mL、蒸馏水1 000 mL混匀，37℃放置24h过滤）；台式高速冷冻离心机（Sigma，3K30，德国SIM）；数显恒温水浴锅（HHS，江苏）；显微镜（DMBA300-B，Motic，中国）；测尺（OBM-1/100，Olympus，日本）。

1.2 方法 有正常繁殖力的公牛、山羊、梅花鹿精液被流式分选和重分析，X、Y精子分别分装于0.25 mL细管，液氮冷冻保存待用。

液氮中分别取出3头牛的X精液、Y精液细管冻精各1管，38℃水浴20 s解冻，精液流入1.5 mL离心管中，加38℃生理盐水至1.0 mL，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重复1次。涂片，干燥后浸入伊红染液60 s，双蒸水水洗，自然风干，镜检。打开Motic Images Advanced 3.2，在“Motic Mccamera1.1”对话框中进行分辨率（800×600）、相片大小（640×480）等的设定，设定完成后点击“拍照”，拍摄测尺和精子照片。打开测尺照片，鼠标指向工具栏中的“线”，在图像窗口拖动鼠标进行测尺长度测量，多次测量取其平均值。根据照片中的测尺长度结果对比测尺实际长度，计算出照片的放大倍数，确定精子放大倍数。打开精子照片，鼠标指向工具栏中的“矩形选区”，用鼠标在分析对象处画出矩形区域，选定所测精子的头部，单击工具栏中的“自动单色分割”，点击工具栏中的“自动计算”，根据“自动计算结果”记录精子头部面积数据。每头牛X精子和Y精子各不重复测量数据300个。

山羊和梅花鹿方法同上。

1.3 数据收集和处理 收集X精子和Y精子头部面积数据，采用SPSS 11.5软件中的Compare Means的Paired-Samples T test程序进行数据统计分析。

2 结果

2.1 公牛精液分选及X和Y精子头部面积差异比较 被选的3头公牛精液分选后重分析的纯度均在99.0%以上，其中171#、203#、176#公牛X精子纯度分别为99.3%、99.4%和99.7%，Y精子纯度分别为99.6%、99.2%和99.5%。由表1可知3头公牛的总体X精子的头部面积极显著高于 Y精子（P＜0.01），X、Y精子面积相差2.96%。

表1 公牛精液X和Y精子头部面积差异比较（n=300）

2.2 梅花鹿精液分选及X和Y精子头部面积差异比较

被选的3头梅花鹿精液分选后重分析的纯度均在89.0%以上，其中 131#、136#、0#鹿 X 精子纯度分别为91.20%、92.0%、90.0%，Y精子纯度分别为 94.1%、93.3%、89.0%。表2结果显示3头梅花鹿的X精子的头部面积均极显著高于Y精子（P＜0.01），X、Y精子面积相差1.18%。

表2 梅花鹿精液分选及X和Y精子头部面积差异比较（n=300）

2.3 萨能奶山羊精液分选及X和Y精子头部面积差异比较 参加分选的1头萨能奶山羊公羊精液重分析的纯度X精子为94.4%，Y精子为96.8%，萨能奶山羊公羊X和Y精子头部面积差异比较结果见表3，结果显示11#萨能奶山羊公羊的X精子的头部面积极显著高于Y精子（P＜0.01），X、Y 精子面积相差 1.35%。

表3 奶山羊公羊精液X和Y精子头部面积差异比较（n=300）

3 讨论

本试验采用的有繁殖力的雄性草食动物精液精子分离纯度均＞90.0%，其中公牛＞99.0%，梅花鹿＞89.0%，山羊＞94.0%。这对于分析X精子和Y精子头部差异是非常有利的，是理想的实验材料。采用伊红Y染色法，从涂片至镜检约10 min，比常规吉姆萨染色、瑞氏-吉姆萨复合染色时间短，且染色效果较好，重复性好，视野清晰，染色均匀。利于拍照和面积测定。

主观评价正常精子形态方法所得结果往往不稳定，电脑辅助精子形态分析仪已经研制成功，为客观分析精子头部形态提供了科学依据［13］。本实验使用Motic Imanges Advanced 3.2系列软件，通过像素点分割自动计算精子头部面积，精确度比较高。但实验通过对所拍摄的精子照片进行像素点分割后自动计算精子头部面积，因而系统所得的“自动计算结果”会因像素点、照片大小等的不同而不同，需根据照片中的测尺长度结果对比测尺实际长度，计算出照片的放大倍数，确定精子实际放大倍数。

本实验测定结果中牛、梅花鹿和山羊X、Y精子头部面积差分别为2.96%、1.18%和1.35%，面积数据经配对t检验，X精子和Y精子头部面积差异均极显著（P＜0.01）。人类精子头部形态分析研究也发现X精子和Y精子头部面积差异的结果［14］，所有精子头部面积测定结果均在正常范围内，但测定结果比报道［12，15］的整体偏大，分析其原因可能染色死精子在显微镜观察时看起来比同类型活细胞大。梅花鹿X、Y精子头部面积差异较小可能和分选纯度有较高关系，而山羊的数据只来自1头公羊，要取得确定的结果还需要进一步增加实验样本数量。

与测定X精子和Y精子头部DNA含量的差异分离XY精子相比，测定精子头部面积差异操作简便快捷、安全，可在短时间内获得大量可用的分离精子［16］。精子头部面积差异结果可为流式细胞仪提供基础数据，对X、Y精子头部面积差异分析测定进而实现两性精子的分离。

4 结论

牛、梅花鹿、山羊X精子的头部面积均极显著高于Y精子；不同分选纯度的公牛精液X精子之间、Y精子之间头部面积差异均不显著（P＞0.05）。

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Analysis on the Differences between X-and Y-sperm Head Area in Bull，Stag and Goat

Gong Chang-hai1，Wang Hui-e2，3，Gao Qing-hua2，3，et al
（1.Xinjiang Bazhou Station of Animal Husbandry，Kuerle 841000，China；
2.College of Animal Science，Tarim University，Alar，Xinjiang 843300；3.Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology，Xinjiang Production and Construction Group，Alar Xinjiang 843300）

Flow sorted frozen-thaw sperm from bulls（n=3，purity≥ 99%），goat（n=1，purity≥ 94%），sika stags（n=3，purity≥ 91%）with proven fertility were conventionally stained，and their X-and Y-sperm head areas were measured by Motic Images Advanced 3.2 software.The results showed that the X-sperm head area of bull（35.84 μm2± 4.12 μm2）was significantly higher than the Y-sperm head area（34.81 μm2± 3.72 μm2）（P ＜0.01），the difference of head areas between X-and Y-sperm was 2.96%；The X-sperm head area of sika stags（33.29 μm2±2.93 μm2）was significantly higher than the Y-sperm head area（32.90 μm2±3.25 μm2）（P ＜0.01），the difference was 1.18%；The X sperm head area of goat （8.53 μm2±3.16 μm2）was significantly higher than the Y-sperm head area（28.07 μm2±3.19 μm2）（P ＜0.01），the difference was 1.35%.It concluded that the head area of X-sperm in bull，sika stag and goat was significantly higher than that of the Y-sperm.

bull；stag；goat；sperm；flow cytometric；head area

2011-01-24

国家自然科学

（30760170）；国家科技支撑计划课题子课题（2008BADB2B05-1-3）

宫昌海（1968-），男，高级畜牧师。

高庆华（1970-），男，教授。E-mail：gsy1997@126.com

1007-9726（2011）03-0009-03

S814.2