草石蚕茎尖脱毒培养及良种繁育体系

刘弘，崔俊林，谭鹏昊，刘松涛，胡功洧

（1.重庆三峡职业学院，重庆万州，404155；2.重庆大德农业开发有限公司）

草石蚕茎尖脱毒培养及良种繁育体系

刘弘1，崔俊林1，谭鹏昊1，刘松涛2，胡功洧2

（1.重庆三峡职业学院，重庆万州，404155；2.重庆大德农业开发有限公司）

草石蚕携带的病毒能通过繁殖器官代代相传、蔓延，导致草石蚕种性退化，产量及品质下降。结合笔者对草石蚕多年的研究成果，从病毒为害、茎尖培养、良种繁育等方面综述了草石蚕的脱毒培养及良种繁育体系，为生产上推广应用草石蚕脱毒良种、提高其产量和品质、促进草石蚕利用等提供参考。

草石蚕；茎尖脱毒培养；良种繁育

草石蚕 （Stachys sieboldiiMiq.）又名甘露子、地蚕、宝塔菜等，为唇形科水苏属多年生草本植物，是我国的特产蔬菜[1～3]，原产于我国北部，现分布在我国南北各地，重庆、江苏、河北、内蒙、陕西和宁夏等地都有种植。草石蚕以地下块茎供食，其富含蛋白质、氨基酸、水苏糖及多种维生素，营养丰富；经盐渍、酱制加工后风味独特，为佐餐之佳品。其块茎不仅可作水果生食或糖渍食，还可入药，性味甘平，入肺经脾，有润肺益肾、滋阴补血等功效，可治疗气喘、肺虚咳嗽、肾虚腰痛等病症。

草石蚕难以形成种子，以地下块茎进行无性繁殖。与马铃薯类似，病毒侵染草石蚕后，能通过繁殖器官代代相传、蔓延，导致草石蚕种性退化，产量及品质下降。曹鸣庆等[4]已在20世纪80年代报道了草石蚕的茎尖分生组织培养和脱病毒系的应用价值研究成果。随着植物组织培养技术的发展，许多方法得以改进。通过对草石蚕病毒病、茎尖组织培养脱毒、脱毒系试管苗离体快繁及保存、脱毒种茎繁育等研究，摸索出一套更经济有效的草石蚕组培脱毒繁殖技术，为草石蚕脱毒良种繁育体系建立及商业化生产提供参考。

1 草石蚕病毒病的为害

为害草石蚕的病毒主要有苜蓿花叶病毒（AMV）、烟草花叶病毒（TMV）和一种属于马铃薯Y病毒组的杆状病毒（粒体长750 nm以下）[4，5]。田间观察到感病毒植株长势较差、叶色淡，逆光可见叶绿素分布不均，呈斑驳花叶症状。生产上可采用指示植物鉴定、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫吸附电镜（ISEM）等方法检测病毒[6]。酶联免疫吸附测定是最常用的病毒检测方法，它可以在较短时间内对大批量样品同时进行定性和定量检测，并且需要的设备条件不高，相对费用较低，但需要获得与标准阳性对照相应的病毒抗血清。免疫吸附电镜方法是（有病毒）阳性检出的最直观可靠的方法，其灵敏度和专一性均比酶联免疫吸附测定方法高，但所需设备昂贵，费用比酶联免疫吸附测定方法高。

指示植物鉴定在防虫网（温）室内进行，将被检标样汁液摩擦接种于指示植物观察指示植物的表现症状。接种时的苗龄因植物不同而不同，豆科植物在2片真叶展开时接种，其他植物可在4～8叶期接种。接种后黑暗或遮光24 h，此后正常光照，7～30 d内观察症状表现。烟草花叶病毒和苜蓿花叶病毒在指示植物上症状反应明显，详见表1。

由于草石蚕离体微繁和贮存比较方便，所以只要精确测出少量不含病毒的植株，就可获得大量脱毒系并长久使用。

2 草石蚕茎尖脱毒培养

2.1 取材、消毒与接种

12月从田间挖取草石蚕块茎，冲洗干净，置于培养室内催芽，室温保持（23±2）℃，约2周后，待块茎顶芽萌发5 mm左右即可取材；也可于翌年早春，待块茎正常萌芽时取材。将已萌芽块茎置于超净工作台上，先用70%酒精浸泡30 s，再用2.5%次氯酸钠（NaClO）溶液浸泡消毒20 min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸去块茎表面水分。在40倍双目解剖镜下，用解剖针剥离顶芽生长点，切取带1～2个叶原基、长0.1～0.3 mm的茎尖作为外植体，并迅速接种到培养基中培养，脱毒效果好、成活率高。

若取不带叶原基的茎尖作外植体进行组织培养，则成活率低，并且经过愈伤组织阶段所产生的苗株变异率会增大。说明叶原基可能提供了茎尖生长和发育的内源激素，利于草石蚕茎尖培养。

2.2 茎尖培养与成苗

表1 病毒在指示植物上的症状

草石蚕茎尖初代培养适宜选用MS＋6-BA 0.2～0.3 mg/L＋NAA 0.05～0.1 mg/L＋GA30.1～0.3 mg/L＋白糖3%＋琼脂0.5%的培养基，pH值5.8～6.0。培养室温度白天23～25℃，夜间18～20℃，空气相对湿度保持在70%～80%。茎尖接种初期在黑暗或室内自然散射光下培养 3～5 d，然后光照培养，光照时间14 h/d，光照强度1 000～4 000 lx，随茎尖发育逐渐增加光照强度。

草石蚕茎尖分生组织培养初期生长缓慢，约2周后可见外植体略长大，约3周后可见茎尖由白色转黄白色，继而黄绿色，约6周后可见茎尖长成长3～5 mm的浅绿色幼茎，无根分化。继续培养，再经1个月左右便可长成高3～5 cm、有少量根的完整植株。初代培养基中加入一定量的植物生长调节剂对于诱导草石蚕茎尖分生组织再生植株有促进作用。其中细胞分裂素是诱导茎尖产生丛生芽的主要物质，但一定要控制浓度，在6-BA浓度高于1.0 mg/L的培养基中，茎尖产生密集丛生芽，成苗虽多，但苗芽细弱，并容易发生愈伤组织化，增加植株变异率；添加少量GA3对促进茎尖再生植株生长有明显的效果。

2.3 脱毒试管苗离体扩繁

将茎尖再生苗分单株（芽）少量繁殖，进行严格病毒检测，然后选择无病毒株系即可进行大量扩繁。草石蚕试管苗繁殖可采取茎段微扦插，将试管苗剪切成带有1个茎节及1对叶片，长约1 cm的茎段转接，适宜选择MS＋白糖3%＋琼脂0.5%培养基，pH值5.8～6.0。培养室温度（25±2）℃，光照时间14 h/d，光照强度3 000～4 000 lx，空气相对湿度保持在70%～80%。草石蚕试管苗在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基中生长良好，约4周即可长成4～6 cm长、有5～7个节，形成少量根、带1～3个侧枝的健壮幼苗，并且可反复继代，继代培养达5 a的试管苗未发现有变异或玻璃化；当添加少量6-BA时，侧芽增多；当6-BA浓度提高到1.0 mg/L时，茎的节间明显缩短，叶片小，培养4周株高仅2.5 cm左右。

草石蚕试管苗在不添加任何植物生长调节剂的MS培养基中，培养4～5周后就可形成少量细而长的根，生根能力较强。但若要进行出瓶移栽，仍应进行生根培养，培育健壮根系,以提高移栽成活率。适于生根的培养基为1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋白糖3%＋琼脂0.55%，pH值5.8～6，培养条件与继代培养相同。生根培养时应根据试管苗生长情况，配制一定比例的生根培养基和继代培养基，剪取株高5 cm左右的健壮幼苗，去掉细根，转入生根培养基中，其余小苗或茎段转入继代培养基中继续扩繁或保存，尽量减少浪费，以降低生产成本。

草石蚕试管苗转入生根培养中培养 7～10 d后，可在培养基内的茎节处看见数条白色、短粗的幼根，待根长1 cm左右，即可进行驯化移栽。生根培养阶段于1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L+6～10 mg/L PP333培养基中培养，能促进根系发育，改善根系质量，增强幼苗抗逆性，提高移栽成活率，并且移栽后缓苗期短，生长旺盛[7，8]。

2.4 脱毒试管苗保存

试验研究发现，在培养室内常温（周年无控温处理）条件下，草石蚕试管苗在MS培养基中保存1 a以上，培养基已干涸，叶片枯黄，但茎秆或茎尖绿色，剪掉枯叶的绿色茎段或绿色茎尖转接，仍能生长成株，并且无变异发生。在草石蚕试管苗继代培养阶段以MS为基本培养基，添加8～10 mg/L PP333或600～800 mg/L CCC能使试管苗明显矮化，茎节粗壮，试管苗的保存期可延长至4～5个月[7，8]。因此，生产上可采用添加植物生长调节剂和降低培养室温度等方法，延长试管苗保存时间，减少继代次数，以便根据需要合理安排生产，节省人力、物力，降低生产成本。

3 草石蚕脱毒种繁育

草石蚕脱毒种繁育可分为原种生产和良种生产两个阶段。与马铃薯脱毒种生产相同，在原种生产和良种生产阶段都要进行严格的隔离保护，以防止病毒再侵染。

草石蚕为短日照植物，不耐高温干旱，喜阴怕涝，遇霜枯死。自然生长条件下以地下茎越冬，翌年3月初（惊蛰前后），温度在8℃以上开始萌芽生长；4月中旬（清明后）温度15℃左右出土，叶片展开；6月下旬（夏至后）生长速度加快，地上部分从茎顶端至叶腋先后开花，随后地下逐渐抽出匍匐茎；9月中下旬（秋分左右）地上部分生长缓慢，同化养分积累，地下匍匐茎顶端开始膨大，形成螺旋状块茎；12月上旬（大雪）过后，地上部分遇霜枯萎，即可收获块茎[9]。生产上应根据草石蚕生长习性及各地气候特点，合理安排生产时期。

3.1 原种生产

原种生产即是将无病毒的试管苗在隔离保护条件下快速繁殖，生产微型种茎。一般在3月下旬，气温稳定在15℃以上，即可安排草石蚕生根试管苗出瓶生产原种。

①基质的选择与处理 脱毒草石蚕试管苗的移栽基质要求疏松、透气性良好，可用蛭石（或珍珠岩）与泥炭土按1∶1混合，或河砂与腐殖质土按2∶1混合作基质，也可在苗床表层铺7 cm左右蛭石（或珍珠岩），下面铺过筛的肥沃、砂壤质园土，再在底层铺5 cm厚粗砂或炭渣，以便透气、滤水。基质需严格消毒，可采取高温处理或甲醛、硫磺薰蒸，以防病虫为害、杂菌感染、杂草滋生。栽前1～2 d基质浇透水，使其沉实，栽苗时保持土壤湿度达60%左右。

②生根试管苗驯化、移栽及管理 将草石蚕生根试管苗培养瓶移入防虫温（网）室内，置于散射光下炼苗3～5 d，再打开瓶盖炼苗3 d，待试管苗叶色变深、茎秆增粗、根伸长且由浅黄色变成深棕色，即可进行移栽。移栽时将试管苗从培养瓶中取出，用清水洗净基部附着的培养基，置于50%多菌灵800～1 000倍液中浸泡1～2 min，再按约10 cm×10 cm的株行距栽入苗床基质内。移栽后叶面喷水，覆盖塑料薄膜和遮阳网，避免阳光直射，保持相对湿度在90%以上，但也不能造成基质积水，以免引起烂根死苗。约15 d，待移栽苗开始发新根和出新叶后，再逐渐揭开遮阳网，适当减少浇水量，一般25 d后成活率可达95%以上。徐梦等[10]报道，剪取具有一个生长点、长2 cm左右的草石蚕无根试管苗茎段，把下部切口放到90 mg/L的IAA溶液中处理5 min，扦插到已经浇透水的苗床基质中，接着喷雾水定根，再按照与移栽生根试管苗相同的环境条件进行管理，15 d后试管苗扦插成活并正常生长，30 d后成活率为92%。因此，在草石蚕脱毒原种生产过程中，可在试管苗出瓶移栽后反复剪苗扦插，以加快繁殖速度，减少室内试管苗生产量，有效降低生产成本。

试管苗移栽或扦插苗成活后，长出3～4片新叶，5月上中旬即可移栽到防虫网室土壤中。草石蚕对土壤要求较严格，在黏土中种植不利块茎膨大，且收获时容易损伤块茎表皮，使其褐变，影响品质；宜在土层深厚、富含有机质、肥沃、排水良好的砂壤土种植。栽植前用磷肥与草木灰混合均匀拌入土中作底肥，土壤要充分消毒，以防止病虫害发生。待苗高15 cm时，于高于地面10 cm处摘心，以促发侧枝，现蕾后及时摘除花蕾，以减少养分消耗。根据苗情，于6月中旬、9月下旬用尿素追肥2次，在地下茎膨大期可叶面喷施磷酸二氢钾液，以利块茎形成、膨大。

③块茎采收与保存 11月下旬至12月上旬，待草石蚕地上部植株自然枯黄后即可采收，挖取地下块茎后，清除粘附其上的泥土，用清水洗净，注意不要擦伤表皮，再用50%多菌灵1 000倍液浸泡约20 min后，晾干，置于低温、通风、干燥条件下保存。不足1 g的细小块茎，容易失水干枯，不便贮藏，也可留于土中，待翌年春季萌发后直接选苗移栽作种。

3.2 良种生产

良种生产是在隔离保护条件下用原种进行1～2代扩繁，生产大田用商品种茎。

①良种繁殖地选择 繁殖良种用地面积增大，可能大部分地区都不具备完全利用防虫网室进行隔离种植的生产条件。草石蚕原生于海拔3 200 m的湿润地。因此，可利用气候冷凉、常遇大风多雾天气，蚜虫少，有翅蚜虫不易飞迁、降落的高海拔地区繁殖良种，以降低生产成本。还可利用林中的空地、四周环山的平地等天然隔离条件好，且无土传病害的地块繁殖良种。种茎繁殖田忌连作，还必须远离蔬菜、油菜和烟草等种植地，同时，还应严格土壤消毒，严防病虫害发生。可采取生石灰消毒，结合施基肥撒施生石灰1 000 kg/hm2于土壤表面，然后进行翻耕整地。

②适时播种、移栽及防治病虫害 草石蚕良种生产应根据各地气候特点适时播种、培育壮苗，并适时移栽、合理密植。良种生产可适当比商品块茎生产的种植密度大一些，可按株行距0.33 cm×0.33 cm，种植密度为90 000株/hm2左右。适当提高种植密度，可控制块茎单个质量，增加块茎数量。目前，草石蚕的主要病害除病毒病以外还有腐烂病，经鉴定该病原菌为尖孢镰刀菌 （Fusarium oxysporum Schlecht）[11，12]。腐烂病发生后应及时清除病株，并用石灰消毒土壤，发病初期可选用50%霉菌净或50%多菌灵800～1 000倍液喷雾，或用50%敌克松800倍液灌根。可选择速灭杀丁、乐果等药交替使用防治蚜虫、红蜘蛛等。

综上所述，将草石蚕组培脱毒种繁育体系建立图示如下（图1）。

4 结论

目前，草石蚕在国内尚属稀特名菜，分布虽广，但栽培面积不大，稍成规模的有江苏扬州、河南偃师、湖北荆门、山东潍坊、重庆黔江等地，但产量较低。草石蚕腌渍加工产品在部分商场、餐厅少有提供，虽受喜爱，但数量有限。由于没有充足的产品供人们鲜食，还未形成食用习惯。草食蚕加工产品出口畅销东南亚市场，但规模仍然很小。我国草石蚕生产发展缓慢，远远不能满足国内外市场的需求。究其原因，主要是由于草食蚕种植普遍粗放，品种退化严重，导致产量较低，并且块茎小、加工品质差，加之生育期较长，种植成本较高，经济效益不佳，因而影响了农民种植积极性。因此，通过组织培养途径建立草石蚕无病毒良种繁育体系，并在生产上广泛推广应用脱毒良种，使草石蚕生产进入良性循环，提高其产量和品质，是促进草石蚕生产发展的有效途径。

图1 草石蚕组培脱毒种繁育体系

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[6]王蒂.植物组织培养[M].北京：中国农业出版社，2004.

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Virus-free Culture of Shoot-tip Tissue and Propagation of High Quality Cultivar ofStachys sieboldiiMiq.

LIU Hong1,CUI Junlin1,TAN Penghao1,LIU Songtao2,HU Gongyou2
(1.Chongqing Three Gorges Polytechnic College,Wanzhou 404155; 2.Chongqing Dade Agricultural Development Co.,Ltd.)

The virus inStachys sieboldiiMiq.can spread from generation to generation through the reproductive organs, which results in the degeneration of cultivar,reduction of yield and decline of quality.To increase the yield and quality ofS.sieboldiiMiq.,and to promote the application ofS.sieboldiiMiq.and its virus-free high quality cultivar,the damage situation of the virus,virus-free culture of the shoot-tip tissue,and propagation system of the high quality cultivar were summarized on the basis of the authors'research achievements.

Stachys sieboldiiMiq.;Virus-free culture with shoot-tip tissue;Propagation of high quality cultivar

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.22.006

重庆三峡职业学院2007年度科学研究计划项目——特菜草石蚕开发研究

刘弘（1958-），女，副教授，从事农业生物技术教学与研究，电话：13658208688，E-mail：lihongyi_333@hotmail.com

2011-08-24