左旋卡尼汀后处理联合预处理对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤作用的研究*

鲍文韬 杨苏民

(1. 青岛大学医学院，山东 青岛 266021; 2.泰山医学院附属泰山医院呼吸重症科， 山东 泰安 271000)

随着心脏科医师手术及经皮冠状动脉介入治疗( PCI) 的广泛开展，缺血再灌注损伤成为临床中必须面对的难题。在早期心外科手术中，通过改变再灌注的条件和状态来预防再灌注损伤，如再灌注时的压力、灌注液的温度和成分等。1986 年，Murry等[1-2]首次提出缺血预处理(IPC)的概念，并且经研究证实在离体模型和活体动物中均有心脏保护作用。我国学者高峰、赵志清等[3-4]提出了缺氧后处理的概念和经典的缺血后处理(IPo) 概念，并用实验证实IPo与IPc对再灌注后心肌具有类似的保护效果,是机体另一种内源性抗再灌注损伤的保护措施。但在临床上由于不易操作等原因，机械后处理无法广泛使用。左旋卡尼汀是已经应用于临床的药物，它对缺血心肌有多重保护作用，特别是能促进再灌注期糖的有氧氧化，调节糖、脂肪酸氧化的平衡，改善心肌的能量代谢。缺血心肌常伴有卡尼汀含量的不足，因此对缺血心肌而言，左旋卡尼汀就显得尤为重要，在临床应用中有着较为广阔的前景。本研究探讨在心脏离体情况下, 应用左旋卡尼汀预处理联合后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响, 为临床心肌缺血性疾病的保护和治疗提供基础的研究资料。

1 材料与方法

1.1材料 雄性Wistar大鼠40只，体重250～300 g，购于泰山医学院实验动物中心(许可证号SCXK鲁20050015))。左旋卡尼汀(L-CN)注射液由常州兰陵制药有限公司生产(5 ml/g，批号为0003271)。CK、LDH 试剂盒购自南京建成生物工程研究所，氯化三苯基四氮唑(TTC)购自上海化学试剂公司，余试剂及设备由泰山医学院附属泰山医院中心实验室提供。

1.2动物模型制备 动物3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。肝素钠(3 mg/kg)充分肝素化1 min后迅速开胸，取出心脏，置于4℃的K-H液中简单修剪多余的血管及脂肪组织。打开Langendorff离体心脏灌注系统，调整流量至15 ml/min，充分排气后将灌注管道插入主动脉，保证灌注管道开口插入主动脉深度不超过主动脉瓣口，打结固定，开始灌注。行逆行主动脉恒温恒压灌注，温度控制在(37±0.2)℃，pH 7.35～7.45，灌注压75 cmH2O，并于灌注过程中持续通入95%O2和5%CO2混合气体。在肺动脉圆锥处剪一小口，使冠脉流出液自然流出。以左冠状动脉主干( LAD)为标志，在左心耳根部下缘约2 mm处，在冠状动脉前降支根部穿一细结扎线，在肺动脉圆锥旁穿出，结扎时采用直径 0.2 cm细塑料管穿过结扎线，收紧或松开结扎线以造成心肌缺血再灌注模型。在该结扎线下方约 0.5 cm处再穿一结扎线，以备结扎。心肌功能测量：剪开左心房经二尖瓣置一聚乙烯球囊于左心室内，通过导管和 BL-420E+生物机能仪连接，向球囊内注入适量生理盐水使左室舒张末压( LVEDP)为 5～10 mmHg，并维持实验始终。避免球囊内混有气泡。选择心脏标准: 平衡灌注末HR> 160次/min, LVSP>75 mmHg，每分钟室性早搏< 2个，不符合上述标准者舍弃后另补充。

1.3实验分组 (1)对照组( Con): 平稳灌流15 min后，左冠状动脉前降支(LAD)阻断45 min, 复灌120 min；(2) 缺血后处理组(IPo): 在复灌开始，LAD给予6次短暂开放/钳夹(开/夹各10秒)；(3)药物后处理组(LIPO): L-CN 10 mol/L于复灌时给予10 min；(4)药物预处理组(LIPc): 在LAD阻断前先给予10 min的L-CN；(5)联合处理组(LIPP): LAD阻断前后分别给予10 min的L-CN。

1.4观测指标 收集再灌注30、60、120 min时冠脉流出液量(收集3 min冠脉流出液取平均值，CF)，液氮罐内保存，实验结束后整批测量再灌注60 min时LDH及CK水平。再灌注 2 h结束后，再次原位结扎左冠状动脉前降支，从主动脉根部灌注1% Evans蓝溶液约2 ml左右。非缺血区蓝染后，用冰冻生理盐水冲洗，之后冻于-20℃冰箱。30 min后用吉列刮胡刀片垂直于心脏长轴将其切成1～2 mm厚的薄片，置于1%TTC(pH 7.4)PBS溶液中，37℃避光孵育15～30 min后置于10%的甲醛溶液过夜。次日，将已染色的心肌薄片用滤纸吸干后按序放置于平板上，其中正常的非缺血心肌组织被Evans蓝染为蓝色，有缺血危险但未梗死的心肌组织被TTC染为红色，梗死区呈灰白色，分离后分别称重，梗死范围以梗死心肌重量与缺血心肌重量之比表示。

2 结 果

2.1灌注前及平稳灌流复灌后60 min时CK及LDH比较 CK及LDH在缺血再灌注前各组之间无明显差异。再灌注60 min后，与Con组比较，CK值在IPo、LIPo、LIPc和LIPP组显著降低，说明单纯机械后处理及药物预处理、后处理具有明显的心肌保护作用。IPo、LIPo、LIPc和LIPP各组间心肌保护作用无明显差异。与Con组比较，在灌注60 min后LDH 在LIPo、LIPc、LIPP组显著下降，而后三组之间无明显差异，说明预处理、后处理及联合处理对心脏LDH影响无明显差异。见表1。

2.2各时间点CF的比较 各组在灌注前基础值无明显差别，复灌30 min、60 min后Con 同IPo、LIPo、LIPc及LIPP组相比均具有明显差异。复灌到120 min时，LIPo组CF值与其他各组相比P<0.05，说明LIPo可能较其它处理组具有更长的改善冠脉流量的作用。见表2。

2.3各时间点HR的比较 在灌注开始前各组心率无明显差异。而再灌注60 mim时，其他各处理组与Con相比P均<0.05，各处理组之间无明显差异。见表3。

表1 灌注前及再灌注60 min 时CK 及LDH比较

注：与Con比较，aP<0.05，bP<0.01。

表2 平稳后及复灌各时间点CF比较

注：与Con比较，*P<0.05; 与LIPo比较，#P<0.05。

表3 平稳后及复灌各时间点HR比较(次/分)

注：与Con比较，aP<0.05。

2.4各组在心肌风险区范围比较 再灌注结束，行心肌梗死测定表明，各组在心肌风险区范围比较无明显差异。LIPo 组心肌梗死区重量从(34.39±1.62)%下降到(28.02±3.10)%(P<0.05)， LIPo、LIPc及LIPP之间无明显差异。

3 讨 论

缺血再灌注损伤日益引起临床医师们的关注，其损伤的重要因素可能与钙离子超载、氧自由基和中性粒细胞聚集等因素[5-6]有关，也与心肌细胞的能量产生及利用障碍紧密相关。左旋卡尼汀是已用于临床的药物，它对缺血心肌有多重保护作用，其保护缺血心肌的作用机制可能主要为：通过减少缺血期长链脂酰肉碱(LCAC) 的堆积减轻了LCAC 对心肌的毒性作用；保护血管内皮细胞，保障心脏的血液供应；左旋卡尼汀能增强心肌清除自由基的能力，阻止氧化应激造成的心肌细胞损伤等。

本实验中左旋卡尼汀预处理、后处理及联合处理的冠脉流量和对照组相比具有显著改变，其中左旋卡尼汀后处理组，120 min后冠脉流量与对照组有显著性差异，说明左旋卡尼汀后处理能有效的保护血管内皮细胞，扩张冠脉，增加冠脉流量。而随着时间的延长，机械预处理、药物预处理及联合处理冠脉保护作用明显较左旋卡尼汀后处理组减弱，其具体原因及机制需进一步研究。而除对照组外，其余各组之间对CK和LDH的影响无明显差异。说明各组均有心肌保护作用，但预处理结合后处理无明显的保护叠加作用。同时，左旋卡尼汀预处理、后处理可以明显改善缺血再灌注后心肌梗死的发生率。

总之，左旋卡尼汀对心肌缺血-再灌注损伤有保护作用，能进一步改善心肌细胞的能量代谢和缺血-再灌注心肌的心功能，增加冠状动脉的血流量，减轻心肌细胞的损伤，对心肌缺血-再灌注损伤有保护作用，为左旋卡尼汀应用临床提供了理论基础。

[1] Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia; a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J]. Circulation,1986,74 (5):1124-1136.

[2] Murry CE, Richard VJ, Reimer KA, et al. Ischemic preconditioning slows energy metabolism and delays ultrastructural damage during a sustained ischemic episode[J]. Circ Res, 1990, 66(4): 913-931.

[3] 高峰,Yan WL ,Geng YJ,等.“缺氧后处理”对大鼠缺氧-复氧心室肌细胞的保护作用[J]. 心功能杂志, 1999, 11(4): 241-242.

[4] Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison wit h ischemic preconditioning[J]. Am J Physiol(Heart Circ Physiol), 2003, 285 (2): 579-588.

[5] 刘秀华. 钠钙交换体与心肌缺血再灌注[J].中国动脉硬化杂志, 2005, 13(2): 233-235.

[6] Salie R, Harper I, Cillie C, et al. Melatonin protects against ischemic reperfusion myocardial damage [J]. J Mol Cell Cardial, 2001, 33: 343-357.