RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响

顾 靓，张阳德

（中南大学卫生部肝胆肠外科研究中心，湖南长沙 410008）

RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响

顾 靓，张阳德*

（中南大学卫生部肝胆肠外科研究中心，湖南长沙 410008）

目的：探讨RNA干扰技术对人肝癌HepG2细胞mTOR的表达及细胞侵袭与转移的影响。方法：体外合成mTOR siRNA，并转染HepG2细胞24 h，同时设无义对照组（转染无义对照siRNA）、空白对照组（转染空脂质体）及正常对照组（不转染）。采用western blot法检测各组HepG2细胞的mTOR蛋白表达；应用Transwell小室细胞体外实验检测转染后肝癌HepG2细胞的穿膜细胞数，评价肝癌细胞体外侵袭和转移能力的变化。结果：mTOR siRNA转染组HepG2细胞mTOR蛋白的表达低于各对照组（P＜0.05）；HepG2细胞侵袭和转移力均显著低于各对照组（P＜0.05）。结论：mTOR siRNA可有效抑制HepG2细胞mTOR蛋白的表达，且能抑制HepG2细胞的侵袭和迁移。

原发性肝癌；HepG2细胞；mTOR；RNA干扰；HepG2细胞；侵袭；转移

原发性肝癌是原发于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤之一。肝癌起病隐匿，发展迅速，恶性程度高，一旦发现多为中晚期，不论是手术还是姑息治疗，效果均不理想。由于肝癌是一种高侵袭、高转移性癌症，临床治疗又易复发转移，使疗效难以提高。据统计，我国肝癌的死亡率在我国各种恶性肿瘤中高居第二位，占全部恶性肿瘤死亡人数的18.8%，每年有10万人以上死于肝癌[1-2]。因此，如何阻断癌细胞侵袭与转移，是目前肝癌研究的热点之一。本研究旨在研究RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞迁移和侵袭力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

肝癌HepG2细胞系购自中国生命科学院细胞库，含高糖DMEM培养基和胎牛血清购自碧云天生物技术公司。RPMI-1640购自美国 Gibco公司。T7 RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒购自美国Promega公司。脂质体Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。兔抗人mTOR单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。兔抗人actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。Transwell小室购自美国Corning公司。基质胶Matrigel购自美国BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 HepG2细胞培养 将冻存于液氮中的肝癌HepG2细胞株取出，迅速放入37～40℃水浴箱中，使其在1 min内融化，无菌条件下打开安瓿，将细胞悬液吸取到培养瓶中，补足培养液，置CO2培养箱（5%CO2，37℃）中培养。待细胞贴壁，换培养液一次，至细胞长成单层后即开始传代。吸去培养液，加1 ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动培养瓶，使胰蛋白酶覆盖整个瓶底。室温消化3～5 min。镜下见细胞皱缩，间距增大时，滴加几滴培养液终止消化。加10%胎牛血清RPMI-1640培养液充分吹打，制成单个细胞悬液，加入10%胎牛血清RPMI-1640培养液的量为原加入量的2倍，即一瓶传成两瓶，置于培养箱内约3 d形成单层即可进行实验。

1.2.2 siRNA的体外合成及细胞转染 siRNA的体外合成参照T7 RiboMAXTMExpressRNAi System试剂盒说明书操作，应用40 g/L琼脂糖凝胶电泳，测定siRNA的长度和浓度，预实验筛选出1段干扰效果较好的特异性siRNA，同时体外转录合成1段无义对照siRNA。将细胞分为4组：正常对照组（不加转染试剂）、空白对照组（转染空脂质体）、无义对照组（转染无义对照 siRNA）、mTOR siRNA转染组。转染组应用Lipofecter脂质体将150 nmol/L mTOR siRNA转染HepG2细胞，转染24 h。每组设3个复孔，重复3次实验。

1.2.3 western-blot法检测mTOR蛋白质表达 转染结束后将细胞裂解液加入培养板中提取蛋白质，用BCA法检测蛋白质含量。每例标本取总蛋白60 μg加热至100℃10 min，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后用半干式电转印仪转移到PVDF膜上。转膜90 min将膜取出，用蒸馏水冲洗，放入5%脱脂奶粉中，37℃摇床上封闭1 h。再将膜放入mTOR的一抗（兔抗人mTOR单克隆抗体，浓度为中1∶400）中4℃孵育过夜，洗膜后放入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠的二抗（1∶2 000）中37℃孵育1 h，洗膜后DAB显色待出现明显条带时，用蒸馏水终止反应。以β-actin（43kD）为内参。凝胶成像系统拍照，获得的图像用软件ImageTool 3.0测灰度值，并与内参相比得其相对值，取3次重复实验结果的均值进行比较。

1.2.4 体外细胞侵袭能力检测 取对数生长期细胞，制备成3×105个/ml的单细胞悬液。Transwell小室正反面分别在超净台紫外线照射灭菌2 h，无菌条件下在24孔Transwell上室聚碳酸酯膜（PVPF膜，孔径8μm）上包被1 mg/ml的Matrigel胶50 μl，37℃放置30 min，使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。在上室的微孔中分别加入上述4组单细胞悬液各100 μl，下室加入含15%FBS的DMEM培养液500 μl作为趋化因子，每组细胞设5个复孔。置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h。取出小室，取出Transwell小室，用棉签仔细擦去上室面剩余培养基和未发生转移的细胞，室温干燥30 min。用0.1%结晶紫在37℃条件下染色30 min。光学显微镜下观察侵袭至膜上的细胞数，每个复孔取5个视野进行计数，并取均数进行统计。

1.2.5 体外细胞迁移能力检测 将Transwell小室超净台紫外线照射灭菌2 h，在上室的微孔中分别加入4组细胞的单细胞悬液（3×105个/ml）100 μl，随后在下室加入含15%FBS的DMEM培养液500 μl，每组细胞设5个复孔。培养、染色、计数方法同侵袭实验。

2 结果

2.1 siRNA沉默mTOR基因的效率

蛋白质印迹法检测显示，正常对照组、空白对照组、无义对照组的相对表达强度分别是 1.35±0.22、1.34±0.26、1.34±0.19，3组间表达差异无统计学意义（P＞0.05）；mTOR siRNA转染组的相对表达强度为0.57±0.13，与各对照组比较均显著降低（P＜0.05）。见图1，其中A组为mTOR siRNA转染组，B组为正常对照组、C组为空白对照组、D组为无义对照组。

2.2 体外细胞侵袭能力检测结果

HepG2细胞体外侵袭实验显示，siRNA mTOR转染组的细胞，穿过Transwell小室Matrigel基质胶的细胞数较正常对照组显著减少（P＜0.05），空白对照组、无义对照组与正常对照组比较则无显著性差异（P＞0.05）。实验结果提示，RNA干扰沉默mTOR基因能降低肝癌HepG2细胞的侵袭力。见表1。

表1 侵袭实验各组HepG2细胞穿膜细胞数的比较（±s）Tab.1 Comparison of transmembrane cell count of HepG2 cell by invasion assay(±s)

表1 侵袭实验各组HepG2细胞穿膜细胞数的比较（±s）Tab.1 Comparison of transmembrane cell count of HepG2 cell by invasion assay(±s)

与正常对照组比较，*P＜0.05*P＜0.05,vs normal control group

组别 n 穿膜细胞数正常对照组空白对照组无义对照组mTOR siRNA组5 5 5 5 86.60±6.88 89.20±7.92 86.60±4.83 44.60±5.41*

2.3 体外细胞迁移能力检测结果

HepG2细胞体外迁移中，各组透过人工膜的细胞数见表2。siRNA mTOR转染组的细胞数量比正常对照组显著减少（P＜0.05），这说明RNA干扰沉默mTOR基因能降低肝癌HepG2细胞的迁移力。而空白对照组、无义对照组间与正常对照组比较均差异无统计学意义 （P＞0.05）。

表2 迁移实验各组HepG2细胞穿膜细胞数的比较（±s）Tab.2 Comparison of transmembrane cell count HepG2 cells in each migration group(±s)

表2 迁移实验各组HepG2细胞穿膜细胞数的比较（±s）Tab.2 Comparison of transmembrane cell count HepG2 cells in each migration group(±s)

与正常对照组比较，*P＜0.05*P＜0.05,vs normal control group

组别 n 穿膜细胞数正常对照组空白对照组无义对照组mTOR siRNA组5 5 5 5 145.60±4.93 145.00±5.83 140.60±6.91 93.00±4.85*

3 讨论

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，我国是原发性肝癌的高发区。肝癌起病隐匿，发展迅速，恶性程度高，一旦发现多为中晚期，失去了手术机会，而化疗、放疗等姑息性治疗，效果亦不理想。虽然早期患者手术切除是首选的治疗方法，但由于85%～90%的肝癌患者伴有肝硬化，较差的肝功能和肿瘤的多中心性生长，患者也往往不能耐受较大范围的肝脏切除术，并且约有一半的手术患者容易病情复发。侵袭和转移是肝癌难于治疗，导致死亡的主要原因。因此，进一步深入研究肝癌细胞侵袭和转移的相关机制，并在此基础上发展出有效的干预手段，对于提高肝癌患者的治疗水平有重要意义。

近几年来，与肿瘤侵袭和转移相关的基因和蛋白质不断被发现。最近发现，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）与肿瘤的发生发展有密切关系。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着关键性的作用。mTOR被认为是磷脂酰肌醇 3-激酶相关激酶 （phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）-related kinase，PIKK）蛋白质家族成员，因为在mTOR的C末端有一个激酶结构域，约234个氨基酸。mTOR可在多种因素的活化下参与基因转录、蛋白质翻译起始、核糖体生物合成、细胞凋亡等多种生物学功能，在细胞生长中处于核心地位[3]。近年来发现，许多肿瘤都伴有mTOR信号通路的异常，mTOR在肿瘤发生密切相关的多种生理病理过程如细胞生长增殖、细胞周期调控、细胞迁移等发挥了重要作用[4-6]。

研究发现TOR信号通路的活化与肝癌的发生也有密切关系，抑制TOR信号通路能够在一定程度上阻止肝癌的进展。Sahin等[7]报道，肝细胞癌组织中mTOR表达增加，且mTOR磷酸化水平显著增强，mTOR特异性抑制剂雷帕霉素预处理肝癌细胞株后，能显著抑制细癌胞的增殖。国外学者通过动物实验研究发现，mTOR另一特异性抑制剂西罗莫司对于肝癌也有良好的治疗效果[8]。黄酮类化合物水飞蓟宾具有很好的抗癌作用，但其作用机制尚不清楚。最近有学者研究发现，水飞蓟宾能显著抑制HIF-1的累积及其转录活性，而HIF-1alpha在肝细胞癌血管发生、侵袭力、转移中发挥了重要作用，但是水飞蓟宾既不影响HIF-1alpha的降解速度也不影响其稳态的mRNA水平。进一步研究发现水飞蓟宾抑制HIF-1alpha与其对mTOR及其下游底物p70S6K、4E-BP1很强的去磷酸化作用有关[9]。Ladu等[10]研究发现，E2F1在人类和啮齿动物肝癌中都可能是关键的抗细胞凋亡因子，其机制与通过拮抗由PIK3CA/Akt/mTOR途径激活介导的c-Myc促凋亡作用。以上研究证明，mTOR参与了肝癌的发生发展，但其具体机制尚有待进一步研究。

RNA干扰也被称为基因沉默疗法，是近年来发现和发展起来的新型基因阻断技术，主要利用双链RNA诱发对宿主细胞特异性RNA转录的抑制，从而抑制特异性基因的表达，具有特异性强、效率高的特点。RNA干扰是基因调节的有效工具，在疾病的治疗方面显示了广阔的前景[11]。RNA干扰在肿瘤研究领域也有了长足的进步，针对细胞凋亡、细胞周期、端粒酶、信号传导通路、新生血管、细胞因子及其受体基因等不同位点而设计的小干扰RNA对肿瘤均有明显的阻抑作用，RNA干扰技术的迅速发展为肿瘤分子靶向治疗开辟了新的途径和领域[12-13]。

本研究结果表明，RNA干扰技术可以显著沉默靶基因mTOR表达。蛋白质印迹法检测显示，正常对照组、空白对照组、无义对照组的相对表达强度分别是1.35±0.22、1.34± 0.26、1.34±0.19，这3组的表达差异无统计学意义（P＞0.05）；mTOR siRNA转染组的相对表达强度为（0.57±0.13），与各对照组比较均显著降低（P＜0.05）。通过RNA干扰特异性地抑制基因的表达来阐明基因在生物体中的功能，较传统方法如基因敲除省时方便。例如使用基因敲除技术敲除一个基因需要6～12个月，而本研究使用RNA干扰技术可以在瞬时抑制目的基因的表达。本研究结果还提示，RNA干扰靶向干预mTOR基因的表达后，能显著降低肝癌HepG2细胞的侵袭力和迁移力。因此，在肝癌靶向基因治疗研究中，mTOR可能成为重要的靶标之一。通过RNA干扰技术沉默mTOR基因，阻止肝癌细胞的侵袭和转移，将为临床上提高肝癌防治水平提供一种新的策略。

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Effect of mTOR gene inhibition by siRNA on invasion and metastasis of human Hepatoma HepG2 cells

GU Liang,ZHANG Yangde*
(Ministry of Health,Central South University,Hepatobiliary&Enteric Surgery Research Center,Changsha City,Hu′nan Province,Changsha 410008,China)

Objective:To study the effect of mTOR siRNA on the expression of mTOR gene,cell invasion and metastasis of human Hepatoma HepG2 cell.Methods:The oligonucleotide templates of mTOR siRNA were designed primarily,then were used to transfect HepG2 with 24 h,and the control groups were established accordingly by using siRNA with insignificant order,liposome only and no transfection.The level of protein of mTOR was measured by western blot. Transwell chamber in vitro was to detect the cell count which were able to invade matrigel membrane to assess the ability of cell invasion and metastasis.Results:The expression of mTOR protein in the groups transfected with mTOR siRNA was lower than that of the control groups(P＜0.05).The invasion and metastasis of HepG2 cells transfected with mTOR siRNA were decreased than those of the control groups (P＜0.05).Conclusion:RNA interference of mTOR in HepG2 cell line could effetively restrain the expression of mTOR,which could significantly inhibit the invasion and metastasis of HepG2 cell.

Hepatocellular carcinoma;HepG2 cells;mTOR;RNA interference;Invasion;Metastasis

R735.7

A

1673-7210（2011）02（c）-014-03

*通讯作者

2010-12-10）