新药23－羟基白桦酸的含量及其他三萜的RP－HPLC测定

王 勇，范春林，王 英，叶文才，3*

(1.江苏省食品药品检验所，江苏南京210008;2.暨南大学中药及天然药物研究所，广东广州510632;3.中国药科大学天然药化教研室，江苏南京210009)

23－羟基白桦酸为从毛茛科植物白头翁(Pulsatilla chinensis Regel)中提纯制得的三萜类化合物是一治疗肿瘤的中药新药的主要成分。体内外抑瘤实验表明，23－羟基白桦酸对B16黑色素瘤细胞具有明显的分化诱导作用，对体内外黑色素瘤增殖有明显的抑制作用。此外，23－羟基白桦酸对多种肿瘤细胞系如人胃癌SGC－7901、人卵巢癌AO、人白血病HL－60、人白血病K562、人宫颈癌Hela细胞及小鼠腹水瘤S180细胞等均有抑制作用［1－4］。本实验在文献的基础上对色谱条件进一步优化，对23－羟基白桦酸原料药质量标准中的含量测定及有关物质检查项进行研究，为该药的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Agilent－1100高效液相色谱系统，G1311A泵、G1365B紫外检测器、色谱工作站。

23－羟基白桦酸对照品(自制，纯度＞98%，面积归一化法测定)，常春藤皂苷元对照品(自制，纯度＞98%，面积归一化法测定)，23－羟基白桦酸原料药 3 批(自制，批号:050401、050402、050403);色谱纯乙腈为Merck公司生产，色谱纯甲醇为Dima公司生产，水为自制双蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax SB－C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm);流动相:乙腈－0.2%醋酸水溶液(62∶38);检测波长 204 nm;流速:0.8 mL·min－1;柱温:30℃;进样体积:20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 23－羟基白桦酸对照品溶液 精密称取23－羟基白桦酸对照品适量，加甲醇超声溶解并定量稀释制成含23－羟基白桦酸0.10 mg·mL－1的溶液。

2.2.2 23－羟基白桦酸样品溶液 精密称取样品10 mg，置于100mL的量瓶中，加甲醇超声处理30 min溶解，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液，即得。

2.3 最大吸收波长的测定

取23－羟基白桦酸对照品适量，照对照品溶液配制方法制成约含10 μg·mL－1的溶液，在波长190～600 nm范围内进行扫描。23－羟基白桦酸在204 nm处有最大吸收，故将检测波长定为204 nm。

2.4 色谱条件的选择

本实验选取几种不同配比的乙腈－醋酸水溶液的流动相，分离度均较好，故以峰的对称因子为指标，对本品的色谱条件进行优化选择，结果确定流动相为乙腈－0.2%醋酸水溶液(体积比=62∶38)。

2.5 系统适用性实验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈∶0.2%醋酸水溶液(体积比=62∶38)为流动相，检测波长为204 nm。理论板数按23－羟基白桦酸峰计算不低于10 000，主成分峰与杂质峰的分离度＞1.5。

图1 23－羟基白桦酸对照品和样品的HPLC图

2.6 线性范围及定量限

精密称取23－羟基白桦酸对照品适量，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 mL中含0.201 6 mg的溶液。精密量取5 mL，转移至10 mL量瓶中，加入甲醇定容，得到浓度为100.8 μg·mL－1的对照品溶液，再逐级稀释，分别得到浓度为 40.32，20.16，10.08 μg·mL－1的溶液，分别取对照品溶液20 μL进样，依照上述色谱条件进行测定，进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到标准曲线，绘制标准曲线，计算回归方程为:Y=19.5X+8.16，r=0.999 9。线性范围为0.2016 ～4.032 μg 。

采用逐级稀释法，当信噪比(S/N)为10时，23－羟基白桦酸的定量限为70 ng。

2.7 精密度实验

精密称取23－羟基白桦酸原料约10.0 mg，置于50 mL的量瓶中，加甲醇超声处理30 min，放冷，稀释至刻度，再取5 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释，定容，过滤，取续滤液，精密20 μL，注入液相色谱仪中，连续进样6次，测定并计算，RSD=0.61%，表明本法精密度较高。

2.8 稳定性考察

精密称取23－羟基白桦酸原料，配成0.1 mg·mL－1溶液，分别在 0、2、4、8 h 进样，测得 23－羟基白桦酸面积，并计算RSD值，RSD=0.9%，表明本品溶液8 h内稳定性良好。

2.9 重复性实验

精密称取23－羟基白桦酸原料6份，按含量测定项下的方法操作，测定并计算，其平均含量为80.9%，RSD=0.8%，表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率实验

精密称取已知含量23－羟基白桦酸原料(批号:050401)适量共 9份，分别精密加入含量的80%，100%和120%的23－羟基白桦酸对照品，按含量测定项下的方法操作，测定并计算，加样回收率分别为 99.2%，101.7%，103.0%，平均回收率为101.9%;RSD 分别为 1.5%，1.1%，0.4%，平均RSD 为1.3%(n=3)。

2.11 含量测定

分别精密称取3批23－羟基白桦酸样品适量，加甲醇超声溶解，并定量稀释，制成含23－羟基白桦酸样品0.1 mg·mL－1的溶液。分别精密吸取对照品溶液和样品溶液，记录色谱图，测定23－羟基白桦酸的峰面积，按外标法计算23－羟基白桦酸的含量。批号 050401，050402，050403，3批样品的平均含量分别为 80.9%，81.3% 和 82.5%;RSD(n=3)分别为 1.0%，1.3%和 1.5%。

根据上述测定结果，确定本品含23－羟基白桦酸，以干燥品计，不得少于80%。

2.12 其他三萜检查

本品中除有效成分23－羟基白桦酸外，还含有一种已知三萜，通过高效液相法，与对照品对照，鉴定其为常春藤皂苷元，通过文献检索未见其毒性报道。对其采用面积归一化法进行限度检查，经检查，3批样品的总杂质含量均＜20%。

3 讨论

23－羟基白桦酸属三萜类化合物，紫外仅在末端有吸收且吸收较弱。由于甲醇的本底吸收较大，故选择乙腈和水做为流动相，为了获得较好的峰形和对称度，考虑在流动相中加入一定量的醋酸，在对以流动相进行的系统适应性试验等大量试验的基础上，确立了色谱条件为乙腈∶0.2%醋酸水溶液(体积比=62∶38)作为含量测定的条件。

本实验对23－羟基白桦酸原料药的含量测定和有关物质检查进行研究，建立了23－羟基白桦酸原料质量控制的含量测定方法、杂质常春藤皂苷元限度的控制标准，为23－羟基白桦酸原料药的质量控制提供了科学依据。所建立的23－羟基白桦酸含量测定方法具有方法简便，可靠，重现性好的特点。

［1］叶银英，何道伟，叶文才，等.23－羟基桦木酸对B16细胞系的诱导分化作用［J］.中国生化药物杂志，2001，22(4):163－165.

［2］叶银英，何道伟，叶文才，等.23－羟基桦木酸体外抗恶性肿瘤作用的研究［J］.东南大学学报:医学版，2001，20(3):14－16.

［3］Ye W C，Zhang Q，Hsiao W W，et al.New lupane glycosides from Pulsatilla chinensis［J］.Planta Med，2002，68:183－186.

［4］Liu W K，Ho J C，Cheung F W，et al.Apoptotic activity of betulinic acid derivatives on murine melanoma B16 cell line［J］.Eur J Pharmacol，2004，498:71－78.