沉香叶提取工艺及其抗氧化活性实验研究

林芳花，彭永宏，江 顺，廖建良，叶海宇

(1.惠州学院生命科学系/生物技术研究所，广东惠州516007;2.惠州龙发山农业发展有限公司，广东惠州516001)

沉香为珍贵濒危的中药材，为瑞香科植物沉香(Aquilaria agallocha Roxb.)或白木香〔Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.〕含黑色树脂的木质部，前者主产于印度和马来西亚等国，称为进口沉香，后者主产于我国海南、广东、广西等省区，为国产沉香［1］，具有行气止痛，温中止呕，纳气平喘等功效，用于胸腹胀闷疼痛、胃寒呕吐呃逆、肾虚气逆喘急等［2］。由于沉香仅以有黑色树脂的木质部入药，其它部分如叶、根等资源没有得到有效的利用。研究者发现沉香叶具有抗炎、镇痛、便秘、肠梗阻、肥胖、出血及脑缺血、降血糖、抗肿瘤等作用［3］，沉香叶产量大，开发前景广阔。因此，对沉香叶进行提取工艺研究，获得经济实用的提取工艺，并评价其抗氧化活性，可以为综合开发利用沉香叶资源提供参考。

1 材料

1.1 药材及药品

野生沉香叶和栽培沉香叶于2010年2月分别采自广东省惠州市秋长镇和广东省惠州龙发山农业发展有限公司秋长镇沉香种植基地，原植物经惠州学院生命科学系廖建良教授鉴定为瑞香科植物白木香〔Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg.〕。采收后于烘箱中50℃干燥，粉碎成粗粉，备用。维生素C:天津市大茂化学试剂厂，批号20100223，分析纯。

1.2 试 剂

无水乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氮蓝四唑(NBT)、核黄素、蛋氨酸、三氯乙酸、氯化铁、铁氰化钾、高锰酸钾、浓硫酸等均为分析纯。

1.3 器 材

FA1104A电子天平(上海精天电子仪器有限公司，精度0.1 mg)、DF－20流水式高速中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)、超声波清洗仪(东莞市三源超声波设备有限公司，频率80KHZ，功率200W)、UV－2450紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。

2 方法

2.1 提取工艺

2.1.1 提取溶剂的选择

分别取栽培沉香叶粗粉约1 g，精密称定，共4份，置50 mL锥形瓶。分别加入10 mL水、20%、50%、80% 乙醇，50℃超声提取30 min，取出，冷却，滤过，滤液置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。稀释5倍，精密吸取稀释液10 mL，置50 mL具塞锥形瓶中，立即加入20% 硫酸溶液2 mL，振摇1 min，立即加入 0.02 mol·L－1高锰酸钾溶液 0.05 mL，计时，当溶液的紫红色完全消退时，记录时间［2］。

2.1.2 提取方法的选择

2.1.2.1 超声提取法 取栽培沉香叶粗粉约1 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，准确加入10 mL 50%乙醇，50℃超声提取30 min，取出，冷却，滤过，滤液置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。稀释5倍，精密吸取稀释液10 mL，按2.1.1节方法测定氧化时间。

2.1.2.2 回流提取法 取栽培沉香叶粗粉约1 g，精密称定，置50 mL圆底烧瓶中，准确加入10 mL 50% 乙醇，回流提取2 h，取出，冷却，滤过，滤液置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。稀释5倍，精密吸取稀释液10 mL，按2.1.1节方法测定氧化时间。

2.1.3 正交试验 以氧化时间为考察指标，以乙醇浓度、溶剂用量、提取时间和提取次数为因素，进行L9(34)正交试验，因素和水平见表1。取栽培沉香叶粗粉约1 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加入溶剂，超声提取，滤过，滤液置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，稀释5倍，精密吸取稀释液10 mL，按2.1.1节方法测定氧化时间，结果用正交设计助手Ⅱ软件进行统计分析。

表1 正交试验L9(34)的因素和水平表

2.2 沉香叶体外抗氧化活性

2.2.1 样品溶液的制备 分别取野生沉香叶和栽培沉香叶粗粉各1 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，加入15 mL 60% 乙醇，50℃超声提取40 min，滤过，滤液置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，稀释5倍，摇匀，备用。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取50 mg维生素C，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

2.2.3 氧化时间的测定 精密吸取待测溶液10 mL，按2.1.1节方法测定氧化时间。

2.2.4 超氧阴离子清除率的测定 精密吸取待测溶液1 mL，按文献方法，于560 nm处测定吸光度，计算超氧阴离子清除率［4］。

2.2.5 总还原力的测定 精密吸取待测溶液0.1 mL，

按文献方法，于 700 nm 处测定吸光值［5］。

3 结果与分析

3.1 提取工艺

3.1.1 溶剂的选择 在所考察的范围内，沉香叶的氧化时间在50% 时达到最低，表明50% 沉香叶提取液抗氧化能力最强，结果见表2。

表2 乙醇浓度对沉香叶氧化时间的影响结果(± s，n=3)

表2 乙醇浓度对沉香叶氧化时间的影响结果(± s，n=3)

乙醇氧化时间(s) 24.66 ±0.08 17.83 ±0.28 11.44 ±0.11 15.74 ±0.12溶剂 水 20%乙醇 50%乙醇 80%

3.1.2 提取方法的选择 超声提取法与回流提法对沉香叶提取工艺的影响，为配对试验，采用配对t检验对实验结果进行统计处理，结果P＜0.01，说明两组方法间有极显著差异，即超声提取法优于回流提取法，结果见表3。

表3 提取方法对沉香叶氧化时间的影响结果(s)

3.1.3 正交试验 氧化时间越少表明还原效果越好，抗氧化能力越强。离极差R的值越大，说明此因素对工艺的影响越大，由RA＞RB＞RD＞RC，可知影响工艺的主次顺序为A(乙醇浓度)、B(溶剂用量)、D(提取次数)、C(提取时间)。方差分析结果显示各因素间没有显著差异，结合生产的实际情况，确定沉香叶的最佳提取工艺为A3B2C3D3，即以15倍60% 乙醇为溶剂，超声提取40 min，提取1次，结果见表4和表5。

表4 正交试验结果与直观分析(± s，n=3)

表4 正交试验结果与直观分析(± s，n=3)

1 1 1 1 1 32.25 ±0.29 2 1 2 2 2 28.15 ±0.24 3 1 3 3 3 18.82 ±0.49 4 2 1 2 3 23.31 ±0.32 5 2 2 3 1 18.42 ±0.45 6 2 3 1 2 21.51 ±0.22 7 3 1 3 2 20.41 ±0.64 8 3 2 1 3 11.59 ±0.32 9 3 3 2 1 18.19 ±0.51 K1 26.407 25.323 21.783 22.953 K2 21.080 19.387 23.217 23.357 K3 16.730 19.507 19.217 17.907 R 9.677 5.936 4.000 5.450

表5 正交试验方差分析表

3.2 沉香叶体外抗氧化活性

以最佳工艺对野生沉香叶和栽培沉香叶进行提取，并评价其体外抗氧化活性。氧化时间越少、超氧阴离子的清除率越大、总还力测定中吸光度越大，表明样品的抗氧化能力越强。栽培沉香叶和野生沉香叶的氧化时间分别为11.53 s和9.98 s，少于《中国药典》的参考值22 s［6］;超氧阴离子的清除率分别为36.26%和35.67%;总还原力测定中吸光度分别为0.188 和0.129，结果见表6。

表6 体外抗氧化活性结果(± s，n=3)

表6 体外抗氧化活性结果(± s，n=3)

与对照组比较，＊:P＜0.05;△:P＜0.01

吸光值栽培沉香叶 2 11.53 ±0.08＊ 36.26 ±0.96＊ 0.188 ±0.008样品浓度(mg·mL －1)氧化时间(s)超氧阴离子的清除率(%)△野生沉香叶 2 9.98 ±0.16＊ 35.67 ±1.25＊ 0.129 ±0.011△维生素C 1 16.45 ±0.25 50.29 ±1.36 0.685 ±0.012

4 小结

分析了乙醇浓度和提取方法对沉香叶工艺影响的规律，结果表明60%乙醇为沉香叶的最佳提取溶剂，超声提取法优于回流提取法。由正交试验可知沉香叶的最佳提取工艺为:以15倍量60%乙醇为溶剂，超声提取40 min，提取1次，该提取工艺简单、重复性好、提取液抗氧化活性强、工艺稳定、无污染。3种体外抗氧化评价结果表明野生沉香叶和栽培沉香叶均具有较强的抗氧化活性。

［1］李锦开，李振纪.中国木本药材与广东特产药材［M］.北京:中国医药科技出版社，1994:110.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［M］.北京:化学工业出版社，2010:172.

［3］中国药科大学.一种沉香叶提取物及其医药和保健用途:中国，CN101011499［P］.2007－08－08.

［4］刘杰超，王思新，焦中高，等.苹果多酚提取物抗氧化活性的体外试验［J］.果树学报，2005，22(2):106－110.

［5］徐亚民，马 越，赵晓燕.紫苏等4种天然色素抗氧化能力的比较［J］.华北农学报，2007，22(2):187－190.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［M］.北京:化学工业出版社，2010:336.