不同仙草种源间遗传关系的ISSR分析

陈菁瑛，刘 萍，黄颖桢，苏海兰

(福建省农业科学院农业生物资源研究所福建省农业科学院药用植物研究中心，福建福州350003)

仙草(Mesona chinensis Benth.)又名凉粉草，是唇形科仙草属一年生草本植物，分布于我国的广东、福建、广西、江西、海南、浙江、台湾和云南等地，印度、印度尼西亚、马来西亚也有分布，我国南方几个省区部分地方有田间栽培习惯。据《中药大辞典》［1］记载，仙草性味涩、甘、寒，具有清暑解渴、凉血之功效。古代医药书《本草求原》记载，仙草有“清暑热，解藏府结热毒，治酒风”的功效，在《岭南采药录》中记载，仙草可治花柳毒入骨。中医认为仙草性凉寒、味甘淡涩，具有清热利湿、凉血解暑、解渴利水和除热毒之功效。现代医学分析测定认为，仙草中的熊果酸和齐墩果酸有降温、镇静、降血糖的作用［2－3］。仙草作为中草药、制作凉粉冻及凉茶在我国已有悠久的历史［4］，随着凉茶申遗成功、凉茶功能认知度的提高以及人们保健意识的增强，凉茶市场份额猛增，王老吉、和其正、龟苓膏、清凉爽等产品陆续登陆市场，厂家争夺仙草原料剧烈;仙草又是南方一些地方传统出口创汇的农产品;随着国内国际市场的需求量日益增大，生产供不应求，野生资源逐渐减少，扩大人工栽培已成为仙草原料的主要来源，福建龙岩、建瓯和广东增城、梅县等地均有大面积的仙草种植基地。调查发现不同种源的仙草在株型、叶片形态和披覆茸毛多少及化学成分含量等方面均存在较大差异，有关不同仙草种源间的遗传背景和亲缘关系的研究更未见报道。为了更好地选择和利用仙草资源满足生产需要，本研究采用ISSR分子标记技术对20份不同种源的仙草进行遗传多样性及亲缘关系的分析，以期探讨仙草种源间的亲缘关系，为仙草的引种栽培、资源保护和选种育种提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试20份仙草种源分别为收集采自我国福建、广东、台湾和广西等省区及印度尼西亚的17个栽培种源、2个野生种源以及印尼与广东朝阳杂交F1代种源，栽种于福建省农科院药用植物中心的药用植物资源保存基地。供试仙草种源的来源地及主要形态特征如表1所示。

表1 供试仙草种源及主要形态特征

1.2 方法

1.2.1 仙草基因组DNA的提取

用改良的CTAB法提取仙草叶片基因组DNA。取仙草幼嫩叶片0.3 g左右，加液氮快速充分研磨至粉末状;将粉末移至2.0 mL离心管中，加入800 μL预热至65℃的2×CTAB提取缓冲液［100 mmol/L Tris－HCl(pH 8.0)、20 mmol/L EDTA(pH8.0)、1.4 mmol/LNaCl、2%CTAB、2%PVP、2% 巯基乙醇］，充分混匀;65℃水浴10 min，期间颠倒数次;加等体积的混合液［氯仿:异戊醇 =24∶1(V∶V)］，于室温下12 000 r/min离心10 min;取上清液至另一离心管，加等体积异丙醇，室温放置5 min，于室温下12 000 r/min离心10 min;用70%(体积浓度)乙醇洗涤DNA 2～3次，风干;将DNA溶于500 μLTE溶液［10 mmol/L Tris－HC1(pH8.0)，1 mmol/L EDTA(pH8.0)］，加入1 μL RNase(10 g/L)并于 37℃温育30 min;加等体积氯仿异戊醇抽提，上清液加入1/10体积3mol/L NaAc，2倍体积冰冷无水乙醇混匀，－20℃放置 10min，12 000 r/min 离心 10min，沉淀用70%乙醇洗涤后加适量TE溶解，－2O℃保存备用。

1.2.2 仙草基因组DNA纯度与浓度的检测

取1 μL DNA 溶液稀释到 50 μL，用 Ependorf Biophotometer检测 DNA的浓度和纯度。取少量DNA进行琼脂糖凝胶电泳，分析DNA质量。

1.2.3 ISSR引物退火温度的确定及PCR扩增

PCR反应总体积为20 μL，其中含模板DNA50 ng，0.5 μmol/L 引物，0.2 mmol/LdNTP，1.5 mmol/LMgCl2，1 UTaqDNA 聚合酶，2 μL 10 ×PCR 缓冲液，加入灭菌的超纯水至20 μL。扩增程序:95℃预变性 3 min;94℃变性1 min，42 ～53℃退火1 min，72℃延伸2 min，共40个循环;最后72℃延伸5 min。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳

PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为TAE，电压为80 V，电泳1.5 h，EB染料染色10 min，用凝胶成像系统观察并拍照。

1.3 数据的统计分析

ISSR分子标记为显性标记，同一引物的扩增条带按同一迁移位置的有带(包括弱带)记为“1”，无带记为“0”的方法进行统计。用NTSYS—PC软件按照UPGMA法进行聚类分析，构建不同种源间的遗传关系树状图。

2 结果与分析

2.1 仙草基因组DAN纯度与浓度检测

采用CTAB法提取的DNA色泽为白色或无色，说明大多数酚类、糖类、蛋白质等物质已被去除。提取得到的仙草基因组DNA经紫外检测测得OD260/OD280比值均在1.7～1.9之间，说明得到的仙草基因组DNA较纯。同时，提取的仙草基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳，各条带整齐、清晰、明亮、基本无降解、完整性好，显示其条带都在15kb以上(如图1所示)，说明所提取的DNA质量较高，完全能达到ISSR分析的要求。

图1 20份仙草基因组DNA的电泳图谱

2.2 ISSR引物适宜退火温度的确定

退火温度是影响ISSR－PCR的重要因素之一，因此适宜退火温度的确定对获得稳定可靠的结果具有至关重要的作用。而引物的退火温度不仅与引物本身的序列有关，还会随物种的不同而改变，因此在进行PCR扩增前必须确定每条引物最适宜的退火温度。

以引物Tm值获得的退火温度为依据进行温度梯度PCR，经电泳之后统计扩增条带数和条带亮度。图为引物850退火温度梯度PCR结果，从图2可以看出，第1和第2泳道的条带清晰且亮，其适宜温度在45～47℃之间，而较高的退火温度可以较少非特异性条带，因此确定47℃为引物850的最适宜退火温度。以同样的方法确定其它引物最适宜的退火温度，结果如表2所示。

图2 引物850退火温度梯度PCR的电泳图谱

2.3 ISSR－PCR扩增结果分析

从40条ISSR引物中筛选得到18条多态性好、条带清晰且稳定的引物，对18条引物进行退火温度梯度实验，最终确定每条引物最适宜的退火温度，最后对20份仙草品种进行扩增，扩增结果如表2所示。ISSR－PCR扩增的片段集中在200～2000 bp，每条多态性引物可扩增出2～10条带，18条引物共扩增出114条带，其中53条为多态带，多态性比率为 46.5%。

表2 ISSR引物及扩增产物多态性水平

图3 引物810扩增20份仙草DNA的电泳图谱

2.4 遗传相似性分析

利用NTSYS－pc软件计算了20份仙草种质间的遗传相似系数，种质间的遗传相似系数介于0.37～0.96之间。其中5号漳州云霄仙草与7号印尼仙草的相似系数最小，为0.37，表明这两份种源间的遗传距离最远。17号广东梅州与18号三明永安的相似系数最大，表明这两者之间可能存在一定的亲缘关系。

2.5 仙草种质亲缘关系的聚类分析

利用NTSYS－pc软件的UPGMA方法对20份仙草进行聚类分析，构建聚类分析树状图。从树状图中可以看出，当遗传相似系数为0.73时，可将供试的20份仙草分为3大类组，其中4号与7号聚为一类，7号仙草来自印尼，4号仙草是印尼与广东朝阳杂交F1代，这与其来源相符合。14号与20号聚为一类，这两个分别来自浦城和武平野生的种源自然聚成一类，进一步验证了ISSR分子标记的可靠性。

图4 供试品种的亲缘关系树状图

3 讨论

在ISSR分子标记中，模板DNA的质量是决定PCR成功与否的关键。只有高质量的DNA才能扩增出清晰的条带。由于仙草叶片当中富含多酚类及多糖类物质［5］，在DNA提取过程中与DNA共沉淀，形成胶状物难以溶解或产生褐变，严重影响了DNA的质量［6］，从而严重影响提取的DNA质量。本研究以新鲜幼嫩的仙草叶片为材料，利用改良的CTAB法提取基因组DNA。CTAB法对提取步骤要求较为严格，提取DNA时，65℃水浴时间需严格控制，过短(小于10min)DNA得率下降，过长则会引起DNA降解或者增加更多的杂质。为了提高仙草总DNA纯度，水浴时间必须严格控制在10～15 min。这与文献报道的提取方法［7］不完全一致。另外为了彻底去除杂质、提高DNA纯度，提取过程中可适当增加抽提次数，提取时需避免剧烈震荡，以防止DNA机械损伤。最后需对提取的DNA进行纯化。

ISSR(Inter Simple Sequence Repeat，简单重复间隔序列)标记是以PCR技术为基础的分子生物学技术，不但具有RAPD标记的简便易行、快速方便等特点，还具有稳定性好、多态性高，所揭示遗传多态性丰富等优点，目前在药用植物的遗传多样性、物种鉴别研究中已有一些研究报道［8－10］。本文通过引物筛选实验，从40条ISSR引物中筛选得到18条多态性好、条带清晰且稳定的引物，通过PCR扩增，纯化处理得到高质量的完全符合PCR扩增的模板DNA，使该方法能够直接应用到仙草种源遗传关系的分析研究中。在实验研究中，不同种源的仙草选取了多个样本进行重复性实验，在稳定的实验体系下，能够得到具有一定稳定性的DNA指纹图谱，表明该方法分析仙草种源遗传关系具有很好的重复性。

UPGM聚类分析结果表明，除来自印尼的7号及其与广东朝阳的杂交后代4号、同为野生的14号和20号外，其他种源间遗传差异较小，说明国外与国内的仙草种源间、野生与栽培种源间的均有较远的遗传距离，遗传背景差异较大。而国内栽培的仙草种源都聚为同一类，可见仙草不同种源间的遗传差异与地理分布联系不紧密，这与麦冬、丹参的研究结果相似［9，11－12］。表明地理距离在仙草的遗传分化中可能并非是主导因素，其遗传分化的因素还需要结合生殖生物学与生态学方面的研究给出科学的评价。

我们收集种源时发现，福建、广东和广西等省区群众均有使用和种植仙草的传统习惯，福建和广东、广东和广西之间各地民间种苗交流频繁，且至今未见历史上仙草栽培中有人工选择的报道，因此，来自福建、广东和广西的仙草栽培种源聚为一类可能与各地间互相引种、未见人工选择有关。说明了仙草栽培种源的遗传背景较为单一，在今后的研究中，应关注野生类型的收集及地域跨度，丰富仙草的种质资源，为仙草遗传育种奠定基础。

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