血脉通2号颗粒对血管内皮细胞 MMPs及其相关因子的研究*

斌霞 奕民 江苏省常州市中医医院心内科(常州 213003）

血脉通2号颗粒对血管内皮细胞 MMPs及其相关因子的研究*

张琪张斌霞张奕民王紫逸江苏省常州市中医医院心内科(常州 213003）

目的:观察血脉通 2号颗粒对血管内皮细胞基质金属蛋白酶(MMPs）及其相关因子的影响。方法:通过体外培养血管内皮细胞,血脉通 2号颗粒含药血清干预,采用血管内皮细胞增殖实验(MTT）检测血管内皮细胞活性,酶联免疫双抗夹心法测定 MMPs及其相关因子的表达。结果:血脉通 2号可增强血管内皮细胞活性,降低转化生长因子(TGF-β）、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN）的水平,对基质金属蛋白酶表达呈剂量相关性抑制作用。结论:血脉通 2号可增强血管内皮细胞活性,在体外可影响 MMPs相关因子的表达,进而抑制血管内皮细胞表达基质金属蛋白酶,具有稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

血脉通 2号颗粒是江苏省名中医张琪用于治疗动脉粥样硬化的系列经验方之一,已制成院内制剂,临证收到良好疗效,为进一步探讨其作用机理,我们进行了实验研究,报道如下。

1 实验材料1.1 细胞、药物及试剂 VEC(人血管内皮细胞）购自上海细胞所,96孔板 (美国 COSTOR公司）DMEM(美国 GBICO公司 ）,小牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司产品）,胰蛋白酶(Typrin,1:250,Amerso,USA）,溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT上海伯奥生物科技公司）,二甲基亚砜(广东光华化学厂有限公司 ）,血脉通 2号颗粒,为常州市中医院自制制剂(成分为生首乌、黄芪、僵蚕、水蛭、赤芍、川芎,主要用于颈动脉粥样硬化的治疗）每 1g颗粒相当于 4.09g生药,由江苏天江药业有限公司提供。洛伐他汀(批号 080902,山东罗欣药业股份有限公司）。

1.2 仪器 倒置显微镜(日本 OLYMPUS公司产品）,5% CO2培养箱 (USA）,酶标仪(国营华东电子管厂）,离心机(北京医用离心机厂）,电热恒温水温箱(上海医用恒温设备厂）;超净工作台(苏州净化设备厂）。

2 实验方法2.1 含药血清的制备 取大鼠 15只,随机分为 5组,每组 3只,给药前禁食 12h,不禁水。各组大鼠每日给药 1次,连续给药 7d。最后一次给药后 2h,大鼠颈动脉取血,分离血清。同组血清合并,56℃水浴灭活 30min,用 0.122um的微孔滤膜过滤除菌,置-20℃保存备用。空白对照组,给予等容积生理盐水;阳性对照组,给予洛伐他汀 6.67mg/kg;血脉通低、中、高剂量组,分别给予血脉通颗粒 7.5g/kg,15g/kg,30g/kg。

2.2 细胞培养 2.2.1复苏与传代:取出贮存细胞 ,37℃水浴中快速融化。把 1～ 2mL冻存细胞的混合物加入到大约10mL完全生长培养基中,轻轻混匀。 500～ 1000转离心 5min。弃去上清。接种于含 8%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、4mmol/L谷氨酰胺、1mol/LHEPES的 HGDMEM培养液中,37℃、5%CO2条件下培养。细胞接种应该至少为 603× 105活细胞 /mL。当细胞生长至单层致密状时,用 0.25%胰蛋白酶消化后以 1:3传代,24h换液,72h再次传代。

2.2.2 细胞分组:阴性对照组:每孔加入 160uL细胞悬液,共 8孔;30min后 ,每孔均加入 40uL培养液;H2O2(100umol/L）模型组:每孔加入 160uL细胞悬液,共 8孔,每孔均加入20uL100umol/LH2O2,30min后,加入 20uL培养液;空白组:每孔加入 160uL细胞悬液,共 8孔 ,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加空白血清;阳性组:每孔加入 160uL细胞悬液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加 20uL阳性组的含药血清;低剂量组:每孔加入 160uL细胞悬液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加 20uL低剂量组的含药血清;中剂量组:每孔加入 160uL细胞悬液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后,再加 20uL中剂量组的含药血清;高剂量组:每孔加入160uL细胞悬液,共 8孔,每孔均加入 20uL100umol/LH2O2,30min后 ,再加 20uL高低剂量组的含药血清。

2.3 血管内皮细胞增殖实验(MTT） 将血管内皮细胞接种于培养瓶中,加入 DMEM培养液于 37℃,5%CO2培养箱中培养,每 2天传代 1次,传代时用 0.25%胰蛋白酶消化2min。

取处于指数生长期的细胞,加入适量 0.25%胰蛋白酶消化2min。用含 10%小牛血清的 DMEM培养液配成细胞悬液 ,用细胞计数板计数后,以培养液稀释细胞,使之配成 2×105/mL细胞悬液,加入 96孔板。使给药组每孔含细胞悬液 160μL,药液占 20μL,生理盐水 20μL,对照组含细胞悬液 160μL,生理盐水 40μL。在 37℃,5%CO2培养箱中孵育 24h。 24h后每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液,37℃温育 4h,吸出 上清液,加入100μLDMSO,混匀后用酶标仪在 490nm处 ,测定每孔 OD值。

2.4 血管内皮细胞 MMPs及其相关因子的蛋白表达检测 用酶联免疫吸附双抗体夹心法测定,按照各试剂盒说明进行操作。

4 结果 4.1 不同浓度血脉通 2号对 H2O2损伤血管内皮细胞活性的影响作用 见表 1,血管内皮细胞活性与细胞阴性对照组相比 H2O2损伤模型组明显下降,而经含药血清作用,低、中、高剂量组和阳性组的细胞活性均有不同程度增加,与模型组对比,有显著性差异,血脉通与阳性组组间比较提示血脉通 2号中剂量组与阳性组增强内皮细胞活性作用相当,而低、高剂量组与阳性组有组间差异,阳性组作用优于低、高剂量组。22

表1 血脉通 2号对 HO损伤血管内皮细胞活性的影响作用(±s）

表1 血脉通 2号对 HO损伤血管内皮细胞活性的影响作用(±s）

组 别 H2O2模型组 空加 H2O2 阳性组 低剂量组 中剂量组 高剂量组 空白不加 H2O2 阴性对照组细胞活性 0.33± 0.06◇ 0.77± 0.03▲△ 0.86± 0.05▲ 0.75± 0.09▲◆ 0.83± 0.06▲ 0.95±0.04▲◆ 1.02± 0.05◇▲ 0.83±0.02▲

注:与空白不加 H2O2对比,△P＜0.01;与模型组对比,▲ P＜0.01;与细胞阴性对照组对比,◇ P＜0.01;与阳性组对比,◆ P＜0.01。

4.2 对血管内皮细胞基质金属蛋白酶及其相关因子的影响 见表 2,模型组和空白组 MMP-2、TGF-β、EMMPRIN发生了明显的变化,较阴性对照组有显著性差异,经含药血清干预后,与模型组相比血脉通 2号高剂量组和阳性组 MMP-2降低有显著性差异,与空白组相比血脉通 2号高剂量组和阳性组MMP-2降低也出现了显著性差异,血脉通高剂量组与阳性组组间比较无差异,提示这两组在降低 MMP-2方面作用相当;与模型组相比血脉通 2号中、高剂量组和阳性组降低 TGF-β出现了显著性差异,与空白组相比血脉通各剂量组和阳性组降低TGF-β也出现了显著性差异,血脉通各剂量组与阳性组组间比较无差异,提示在降低 TGF-β方面血脉通各剂量组与阳性组作用相当;与模型组相比血脉通 2号各剂量组和阳性组降低EMMPRIN出现了显著性差异,与空白组相比血脉通 2号各剂量组和阳性组降低 EMMPRIN也出现了显著性差异,血脉通高剂量组与阳性组组间比较无差异,提示在降低 EMMPRIN方面血脉通高剂量组与阳性组作用相当,而血脉通低、中剂量组与阳性组组间比较有差异,提示阳性组作用优于低、中剂量组。

表2 血脉通 2号对血管内皮细胞基质金属蛋白酶及其相关因子表达的影响(±s）

表2 血脉通 2号对血管内皮细胞基质金属蛋白酶及其相关因子表达的影响(±s）

注:与正常组对比△ P＜0.05,▲P＜0.01;与模型组比较◇P＜0.05,◆P＜0.01;与空白组比较□ P＜0.05,■P＜0.01;与阳性组比较○ P＜0.05,● P＜0.01。

组 别 孔 数 给药剂量(mL） MMP-2(ng/mL） TGF-β(pg/mL） EMMPRIN(pg/mL）阴性组 8 0.5 2.98± 0.86 51.50± 10.49 15.09± 4.81空白组 8 0.59.26± 2.23▲ 105.70± 12.43▲ 139.11± 2.94▲模型组 8 0.59.33± 0.56▲ 102.53±2.06▲ 143.09± 4.70▲阳性组 8 0.55.51± 1.96◆△■ 74.41±15.07◆▲■ 30.22±4.47◆■▲低剂量组 8 0.57.75±1.99▲○ 88.73±13.79▲○ 43.97± 1.87◆▲■●中剂量组 8 0.57.64±0.82▲○ 86.49±7.33◇▲□ 36.98± 9.09◆▲■○高剂量组 8 0.55.75± 1.02◆▲■ 81.79±14.33◆▲■ 30.59±2.32◆▲■

5 讨 论 血管内皮细胞处于血液和血管壁组织之间,易受多种因素的损伤。研究证明,血管内皮细胞的结构损伤和功能障碍是许多血管病变的始动因素,与冠心病、高血压等疾病的发生发展密切相关。本实验采用体外培养的血管内皮细胞,用 H2O2损伤,血脉通 2号含药血清干预,观察对内皮细胞增殖活性的直接作用及对 H2O2所致内皮细胞损伤的保护作用。研究发现,血脉通 2号可以增强血管内皮细胞的活性,用于血管内皮损伤的修复,对 H2O2所致的内皮增殖活性的抑制具有良好的保护作用。

基质金属蛋白酶与动脉粥样硬化斑块的稳定性密切相关,其表达受到一些调控因子的影响。其中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子 (extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EMMPRIN）是 MMPs的主要调节因子,EMMPRIN不仅诱导MMPs的产生而且与多种细胞及细胞因子相互作用参与 AS的发生发展过程。EMMPRIN通过自分泌和旁分泌途径,诱导成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等表达基质金属蛋白酶[1,2]。EMMPRIN在动脉粥样硬化相关细胞以及人类动脉粥样硬化斑块内高表达[3～5],在富含平滑肌细胞的颈动脉斑块中低度糖基化的 EMMPRIN含量很高并与 MMP-2表达呈正相关,而在富含巨噬细胞的斑块中多为高度糖基化的 EMMPRIN并与MMP-9表达量呈正相关[5]。本实验发现,血脉通 2号低、中、高剂量组的 EMMPRIN与模型组和空白组相比均出现了有统计学意义的差异,与 MMP-2下降呈直线相关。

转化生长因子-β(TGF-β）通过对 MMPs和 TIMPs家族成员因细胞类型而异的基因表达调控作用,表现出调节 ECM重建的生物学效应[6]。TGF-β可通过激活 Smad通路、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK）通路,以及刺激激活蛋白-1(AP-1）复合体的形成,完成对 MMPs和 TIMPs基因表达的调控功能。目前未见 TGF-β对血管内皮细胞 MMPs和 TIMPs调控的报道,本课题在观察 MMP-2表达的同时,检测 TGF-β在血管内皮细胞内的蛋白表达,实验结果表明,血脉通 2号中高剂量组和阳性组TGF-β、MMP-2表达水平下降,与模型组相比有显著性意义,两者均呈现逐渐下降趋势。

血脉通 2号颗粒以“补肾益精、泄浊化瘀”为则立方,是治疗动脉粥样硬化的经验方。本实验观察到该方对影响 MMP-2分泌的 EMMPRIN、TGF-β产生了抑制作用,对 MMP-2在血管内皮细胞内的表达有抑制作用,推测是通过影响其相关因子进而抑制 MMP-2的表达,此为中药复方制剂的综合作用,具体是复方中什么药物或成分有抑制 MMP-2的作用,目前尚未见相关报道,须进一步研究以明确。

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血脉通 /药效学 大鼠 实验研究

R28

A

1000-7369(2011）01-0101-03

*江苏省常州市科技局基金项目(CS20092026）

(收稿 2010-07-30;修回 2010-09-01）