FHIT基因在胃癌中的甲基化表达及其与胃癌临床病理特征的关系

杨 健，胡宏波，贾安平，梁秀兰，刘振鹏，詹前美

(柳州市柳铁中心医院消化内科1，检验科2，广西 柳州 545007)

FHIT基因在胃癌中的甲基化表达及其与胃癌临床病理特征的关系

杨 健1，胡宏波2，贾安平1，梁秀兰1，刘振鹏1，詹前美2

(柳州市柳铁中心医院消化内科1，检验科2，广西 柳州 545007)

目的探讨胃癌(GC)组织中脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的甲基化表达及其与胃癌临床病理特征的关系。方法选取我院胃镜检查诊断为胃癌的74例患者及36例慢性胃炎患者为研究对象。应用甲基化特异性PCR(MSP)检测两组胃黏膜中FHIT基因的甲基化状态，对比相应的病理特征并进行分析。结果胃癌组与对照组组织中FHIT基因甲基化阳性率分别为51.4%及5.6%，胃癌组FHIT基因甲基化阳性率显著高于对照组(P＜0.05)，且甲基化表达与GC患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位及组织学类型无关(P＞0.05)，与病变的浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P＜0.05)。结论FHIT基因甲基化修饰参与胃癌的发生发展过程，可反映胃癌侵袭转移的程度。

胃癌；FHIT基因；甲基化；病理

胃癌(GC)是消化道最常见的恶性肿瘤，全球大概每年新增90万胃癌患者。众所周知，胃癌的发生发展是一个复杂的多阶段的过程，是多种相关基因发生失常的结果。染色体3p14.2的脆性组氨酸三联体(FHIT)基因是一个候选肿瘤抑制基因，该基因改变、转录异常和表达丢失与肿瘤的发生发展存在着密切的关系[1]。我们采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)对胃癌组织中的FHIT基因启动子区甲基化状况进行检测，并与其临床病理特征对比，旨在探讨FHIT基因甲基化状态及其与胃癌临床病理特征的关系，揭示FHIT基因甲基化状态在胃癌发生发展中的作用。现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料 2006年1月至2009年10月我院门诊及住院患者，经胃镜检查并经手术及病理证实为GC的患者74例，男46例，女28例，年龄36～87岁，平均58.5岁；高分化胃癌18例，中分化胃癌21例，低分化胃癌35例；肿瘤直径小于5cm 53例，大于5cm 21例；贲门胃底11例，胃体26例，胃窦37例；临床病理学分期采用国际抗癌联盟1997修订的TNM分期标准，其中Ⅰ期19例，Ⅱ期13例，Ⅲ期20例，Ⅳ期22例。对照组36例，男16例，女20例，年龄28～65岁，平均45.4岁，均为胃镜下诊断慢性浅表性胃炎(CSG)患者。所有病例均取典型病变组织一份，样本离体后30min内均迅速放置于-80℃冰箱中。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取 参照大连TaKaRa公司试剂盒说明书进行，提取产物用美国Bio-Rad公司SmartSpec plus核酸测定仪检测DNA的浓度和纯度，如OD260/OD280在1.6～1.8之间则置于-20℃的冰箱备用。

1.2.2 甲基化检测 亚硫酸氢盐修饰参照美国Epigentek公司产品说明书进行。将已修饰的DNA，分别用甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物进行PCR扩增。引物设计参照文献[2]，引物和扩增参数见表1。PCR反应体系的构成:Taq酶0.5 μl，模板 DNA 2.5 ng，上游引物(20 μmol/L)1 μl，下游引物(20 μmol/L)1 μl，GC Buffer I 25 μl，dNTP(含 Mg2+)8 μl，灭菌蒸馏水加至50 μl，共35个循环，最后72℃延伸8min。PCR产物行2%琼脂糖电泳，80 V，120min，溴化乙锭染色，结果经美国Bio-Rad公司凝胶成像系统进行分析。

表1 FHIT基因引物和扩增参数

1.3 统计学分析 应用统计分析软件SPSS 14.0进行χ2检验或者Fisher精确检验，判定标准：P＜0.05为差异有统计学意义。相关性分析采用Spearman检验。

2 结果

2.1 FHIT基因的PCR产物 FHIT基因MSP和非甲基化特异性PCR片段长度均为74 bp，上述片段长度均与预期相符(见图1)。

图1 UreB基因PCR产物和FHIT基因的MSP分析

2.3 FHIT基因的甲基化状态 74例GC组织中FHIT基因启动子区甲基化阳性为38例，检出率为51.4%，其中完全甲基化9例。CSG组织中FHIT基因启动子区甲基化阳性为2例，检出率为5.6%，均为部分甲基化。GC组织与CSG组织FHIT基因甲基化检出率比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 FHIT基因的甲基化状态在胃癌组织、慢性胃炎组织中的表达

2.4 FHIT基因甲基化与GC临床病理特征的关系 统计学分析显示，FHIT基因甲基化与GC患者甲基化表达与GC患者的与患者年龄、性别、肿瘤大小、部位及组织学类型无关(P＞0.05)，与病变的浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P＜0.05)。见表3。

表3 FHIT基因甲基化与胃癌临床病理特征的关系

3 讨论

胃癌是人体中最多发、危害最大的恶性肿瘤之一。而我国是胃癌高发区，在我国胃癌年发病率和病死率居恶性肿瘤首位，是世界平均水平的两倍多。大量的研究表明，胃癌的形成常伴随着抑癌基因启动子区域CpG岛的异常甲基化修饰。脆性组氨酸三联体基因(Fragile histidine triad，FHIT)是1996年Ohta等[3]和Zimonjic等[4]发现的一种新的候选抑癌基因，已在多种肿瘤中发现有该基因的异常。FHIT基因位于人类染色体3p14.2上，其cDNA由10个外显子组成，外显子5～9组成一个长约500 bp的开放性阅读框，编码是由147个氨基酸组成的相对分子量为16.8 kD的蛋白质。该基因表达蛋白参与一系列的细胞进程，包括对细胞周期调控、细胞凋亡和微管活动的调节以及二腺苷三磷酸(AP3A)的水解等[5]。由FHIT基因启动子区高甲基化导致的表达静默被认为是引起GC发生的分子机制之一，并且已经在GC组织中得到了证实[2]。Leal等[6]对78例胃癌及癌旁组织进行FHIT基因甲基化检测，结果胃癌组织甲基化阳性率为53.9%。戴观荣等[7]检测88例胃癌组织FHIT基因甲基化情况，结果发现阳性患者为35例(40%)。本组检测结果显示：FHIT基因在74例GC组织中有38例发生甲基化，甲基化率为51.4%，在胃炎胃黏膜组织甲基化阳性率为5.6%，两组差异有统计学意义(P＜0.05)；胃癌组甲基化率与Leal等[6]的研究结果53.9%比较接近，但与参考文献[7-8]报道的40%和62%有一定差异，可能与患者的遗传背景和实验方法的差异有关。我们进一步分析甲基化表达与胃癌临床病理特征的关系，结果显示：甲基化表达与GC患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位及组织学类型无关(P＞0.05)，与病变的浸润深度、淋巴结转移和远处转移有关(P＜0.05)。根据胃癌的TNM分期标准，肿瘤的浸润深度、胃周淋巴结转移及远处转移分别是3个重要的方面，它们不但反映病变的早晚，是临床判断预后的重要标准，也直接反映出肿瘤侵袭与转移的能力，本研究结果表明癌组织中FHIT的甲基化表达与胃癌的TNM分期有相关性，这提示FHIT的甲基化与胃癌侵袭与转移的能力相关，有可能成为临床判断胃癌患者预后的指标之一。由于FHIT的甲基化与胃癌的发生和发展存在相关性，则研究它影响胃癌的侵袭与转移的途径不仅能探索研究肿瘤转移的机制，而且对临床防治肿瘤有重要意义。

综上所述，笔者认为FHIT甲基化参与胃癌的发生发展，且与临床病理有一定关系。FHIT基因甲基化修饰在GC发生发展中起重要作用，可作为反映胃癌侵袭转移的生物学指标之一。

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Methylation of fragile histidine triad gene in gastric cancer and its association with helicobacter pylori

YANG Jian,HU Hong-bo,JIA An-ping,et al.Department of Labortory Medicine,the Central Hospital of Liuzhou Railroad，Liu⁃zhou 545007,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the methylation of fragile histidine triad(FHIT)gene and explore possible relationship between FHIT methylation and clinicopathological features of gastric carcinoma(GC).Methods74 cases with GC and 36 cases with chronic gastritis diagnosed by gastroscopy were selected as study cases.Methylation specific PCR(MPC)was performed to test the methylation status of FHIT gene in the gastric mucosa of the two groups.The corresponding clinicopathological features between them was also contrast analyzed.ResultsThe methylation rate of FHIT in tissues from GC group and control group was 51.4%and 5.6%respectively.The methylation rate of FHIT in GC was significantly higher than that in control group(P＜0.05).FHIT methylation was related to the depth of invasion,metastasis in lymph node and metastasis in distance(P＜0.05),while it has no relationship with age,gender,tumor size,tumor location and histological type.ConclusionMethylation of FHIT gene takes part in the progression of GC and it can reflect the degree of invasion and metastasis in GC.

Gastric carcinoma;Fragile histidine triad FHIT gene;Methylation;Pathology

R735.2

A

1003—6350（2011）10—041—03

杨 健（1972—），男，广西玉林市人，主治医师，硕士，主要从事消化道疾病的诊断。

2011-02-01)