54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

闫李侠，黄至澄，徐黔宁，陈保文，王国治

(1、台州市第一人民医院，浙江台州 318020；2、中国药品生物制品检定所 100050)

54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列分析

闫李侠1，黄至澄1，徐黔宁1，陈保文2，王国治2

(1、台州市第一人民医院，浙江台州 318020；2、中国药品生物制品检定所 100050)

目的分析54株分枝杆菌国际参考株16S rRNA序列，为临床分离株的鉴定提供参考。方法用16S rRNA序列分析法对54株分枝杆菌国际参考株进行分析，构建系统发育树，计算相似性百分比。结果除11株(共9种4组)分枝杆菌，即产鼻疽分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌；溃疡分枝杆菌与海分枝杆菌；堪萨斯与胃分枝杆菌；3株结核分枝杆菌与田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌16S rRNA基因序列完全相同无法相互鉴别，其它41株(共41种)分枝杆菌菌种间16S rRNA均不相同可以得到很好的鉴别。结论16S rRNA基因序列分析是一种很好的鉴定分枝杆菌的方法，国际参考株16S rRNA基因序列的研究弥补了基因数据库的不足。

分枝杆菌；16S rRNA；序列分析

rRNA基因被称为细菌的“活化石”，是目前细菌系统发育分类与鉴定的最常用靶基因。rRNA基因存在染色体上，包括长约1.6kb的16S，3.3kb的23S，0.12kb的5S基因。由于16S rRNA基因的长度适中，并且高变区序列具有细菌属、种的特征，因而16S rRNA基因的序列测定已作为细菌分类和鉴定的“金标准”[1]。但16S rRNA基因序列分析定要想成为一种临床检测的常规方法，还需要一个强大的质控序列数据库[2，3]；而目前的数据库还不够完善，甚至数据库的有些信息是错误的[4]，这在一定程度上限制了分子鉴定技术的临床应用性。分枝杆菌国际参考株为国内外分枝杆菌研究的标准对照株，起实验质量控制作用。但到目前为止尚无54株国际参考株16S rRNA基因的系统研究报道。本研究的目的在于分析54株国际参考株16S rRNA基因序列以补充基因库中尚未公布的部分分枝杆菌基因，为实现16S rRNA基因分析方法的常规性提供了重要的基础条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株：实验所用国际参考菌株54株均由ATCC引进并在中国医学细菌保藏管理中心保藏。

1.1.2 PCR引物和测序引物：上游引物(位于分枝杆菌 16Sr RNA 基因的 62～85 位核苷酸)：5′-CAC ATG CAA GTC GAA CGG AAA GG-3′下游引物(位于分枝杆菌 16S rRNA 基因 626～647位核苷酸)：5′-GCC CGT ATC GCC CGC ACG CT-3′。上下游引物扩增16S rRNA基因5′端～585bp片段，测序引物与扩增引物相同。引物均由上海英俊生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA制备 将实验菌株接种于改良罗氏培养基斜面上，慢生长分枝杆菌37℃或28℃培养2～3周，快生长分枝杆菌培养5～7d。将培养物混悬于1ml 0.9%生理盐水中，12000r/min离心5min弃上清，加入 200μl TE 缓冲液，100℃煮沸 15min，12000 r/min4℃离心20min，取含有DNA的上清液置于另一灭菌EP管中于－20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 在50μl反应体系内PCR扩增，10×PCR buffer 5μl，上游引物和下游引物终浓度各0.2μmol/L，4 ×dNTP 终 浓 度 各 为 0.2mmol/L，rTaq DNA聚合酶2U，DNA模板10～15ng，加双蒸水至50μl。94℃预变性 5min，扩增条件 94℃ 1min，64℃1 min，72℃ 1min，共 30 个循环，72℃延伸 7min。

1.2.3 DNA纯化与测序 使用Takara公司生产的DV805A纯化试剂盒回收纯化目的DNA、所有DNA样品送上海生工生物工程公司做上、下游测序并将双向结果拼接后得到最准确序列。

1.2.4 核苷酸序列分析 对所测定序列用Clustalx 1.83软件进行同源性多序列比对，并用邻位相连法(Neighbour Joining,N-J法)绘制16S rRNA基因序列聚类分析树状谱，使用DNAStar的MegAlign软件计算相似性百分比。

2 结果

2.1 54株分枝杆菌参考株16S rRNA基因PCR扩增：成功完成54株分枝杆菌的16S rRNA基因PCR扩增，均得到一约585bp的16S rRNA 5′端DNA片段，与目的条带大小相符，见图1。

图1 分枝杆菌16S rRNA基因5′端PCR扩增结果

图2 分枝杆菌参考株16S rRNA基因5′端DNA多序列比对

图3 依据分枝杆菌标准株16S rRNA基因构建的聚类分析树状谱

图4 54株分枝杆菌参考株之间的相似性百分比

2.2 54株分枝杆菌参考株16S rRNA基因序列测定：完成54株分枝杆菌16S rRNA基因的上、下游序列测定，得到其双向拼接结果。

2.3 54株分枝杆菌之间16S rRNA基因序列分析：通过54株分枝杆菌之间同源性序列比对 (见图2)，绘制16S rRNA基因序列聚类分析树状谱 (见图3)，计算株间相似百分比(见图4)。发现其中11株分枝杆菌，即产鼻疽分枝杆菌(95012)与塞内加尔分枝杆菌 (95041)；溃疡分枝杆菌 (95004)与海分枝杆菌(95014)；堪萨斯分枝杆菌 (95013)与胃分枝杆菌(95006)；3株结核分枝杆菌 (95052)(95053)(95054)与田鼠分枝杆菌 (95048)、非洲分枝杆菌(95049)16S rRNA基因序列完全相同无法鉴别，各组对之间相似性百分比为100%，其它43株分枝杆菌16S rRNA核苷酸序列长度及排列具有较高变异性，16S rRNA基因相似性百分比为91.7%～99.6%，所测定分枝杆菌的16S rRNA基因5′端既含有属特异的保守区域，又含有两个种特异的高变区，分别位于第60～170位核苷酸和位于第340～430位核苷酸区域。

3 讨论

由于16S rRNA基因的长度适中，并且高变区序列具有细菌属、种的特征，因而16S rRNA基因的序列测定已作为细菌分类和鉴定的“金标准”。本研究中16S rRNA基因序列分析可以对大部分分枝杆菌种进行准确鉴定，不足之处在于分枝杆菌种间16S rRNA基因多态性相对较低，常常无法区分某些亲缘关系密切的种或同一菌种内的不同菌株，如研究中报道16S rRNA基因无法区分堪萨斯与胃分枝杆菌；塞内加尔与产鼻疽分枝杆菌；海与溃疡分枝杆菌；MTC各成员[5，6]。要想对上述11株16S rRNA基因序列相互之间完全相同的分枝杆菌加以鉴别可能还要探索其他更有效的方法。

16 S rRNA基因序列分析与传统生化方法相比GC和HPLC可以做到快速鉴定，但是两者都需要昂贵的实验仪器，检测结果依赖于分枝杆菌标准的生长状态，容易受不同温度，不同培养基的影响，结果分析通常比较困难。16S rRNA基因分析并不需要标准的生长状态，其更准确，更实用。文献上报道[7]GC和HPLC不能鉴别M.triplex和 M.fortuitum，M.chelonae 和 M.abscessus，M.avium 和 M.intracellulare，在我们的研究中16S rRNA基因序列分析可以将其鉴别。

54 株国际参考株16SrRNA基因分析结果表明，该序列分析能将MTC和NTM相鉴别，将大部分NTM鉴定至种的水平。除16S rRNA基因外，近年来16S-23S rRNA ITS用于细菌菌种鉴定的研究也越来越多。在黄至澄[9]等的研究报道中16S-23S rRNA ITS序列分析不能鉴别灰尘(95030)与微黄分枝杆菌(95040)；田野(95043)与千田分枝杆菌(95046)；抗热(95025)与副偶然分枝杆菌(95036)；奥布(95035)与母牛结核分枝杆菌(95051)；杜氏(95029)与猪分枝杆菌(95039)；金色(95027)与东海分枝杆菌(95038)。而在我们的研究中16S rRNA基因序列分析可以将其很好的鉴别，说明16S rRNA基因与16S-23S rRNA ITS是在不同水平上提供细菌种系发育鉴别的两个靶基因。两个靶基因结合分析可以将54株国际参考株的大部分分枝杆菌鉴别开，本研究进一步证实此方法的可靠性和实用性。

16 S rRNA基因分析要想成为一种临床检测的常规方法，还需要一个强大的质控序列数据库；而目前的数据库还不够完善，甚至数据库的有些信息是错误的。GenBank中也只能查到部分分枝杆菌标准株的16S rRNA基因序列，这在一定程度上限制了分子鉴定技术的临床应用性。国际参考株为国内外分枝杆菌研究的标准对照株，起实验质量控制作用。但到目前为止尚无54株国际参考株16S rRNA基因的系统研究报道。本研究为实现16S rRNA基因分析方法的常规性提供了重要的基础条件。54株国际参考株为中国药品生物制品检定所收藏株，对标准株16S rRNA基因序列研究与公布为实现国家医学微生物资料共享试点中分枝杆菌资源共享迈出第一步。

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[3]Cloud JL,Conville PS,Croft A,et al.Evaluation of partial 16S ribosomal DNA sequencing for identification of nocardia species by using the Micro Seq 500 system with an expanded database[J].J Clin Microbiol,2004,42:578-584.

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Analysis of the genotype in 54 reference strains of Mycobacteria based on 16S rRNA gene sequences

YAN Lixia,HUANG Zhicheng,XU Qianning,et al.Taizhou First People's Hospital,Zhejiang Taizhou 318020,China

ObjectiveTo analyze the genotype in 54 reference strains of mycobacteria for the identification of clinical isolates.MethodsThe genotypes in 54 reference strains of mycobacteria were analyzed with 16S rRNA sequence,then phylogenetic tree was constructed and similarity was calculated.ResultsWith the sequencing of 16S rRNA in the 54 reference strains of mycobacteria,all the mycobacteria could be discriminated except M.farcinogenes and M.senegalense;M.ulcerans and M.marinum;M.gastri and M.kansasii;3 strains of M.tuberculosis and M.microti,M.africanum.Conclusions 16S rRNA gene sequence analysis is a reliable method to discriminate mycobacteria.The study of the genotype in 54 reference strains of Mycobacteria is compensation for Gene database.

Mycobacteria；16S rRNA；Reference strains

R378.91,R446.5

A

1674-1129(2011)05-0469-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2011.05.003

国家科技重大专项课题，编号：2009ZX10004-805

闫李侠，女，1981年1月生，毕业于兰州大学临床医学院，硕士研究生，临床检验诊断学专业，主管检验师，研究方向：微生物与分子生物学。