应用响应面法优化铆钉菇菌丝体胞外多糖提取工艺

冮洁，刘凯，刘丹华

（大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116605）

应用响应面法优化铆钉菇菌丝体胞外多糖提取工艺

冮洁，刘凯，刘丹华

（大连民族学院生命科学学院，辽宁大连 116605）

采用响应面法对铆钉菇菌丝体胞外多糖的提取工艺进行优化，以提取液中多糖含量为响应值。结果表明，影响铆钉菇菌丝体胞外多糖提取的主要因素依次为:提取温度、料液比、提取时间;获得的各因素最佳水平为:提取温度6℃，提取时间5 h，料液体积比1∶4.4。在此优化条件下，所得胞外多糖的质量浓度为278.86 mg·L－1，比优化前提高了20.40%。

铆钉菇;菌丝体;胞外多糖;提取;响应面法

铆钉菇（Gomphidius rutilus），担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，铆钉菇科。铆钉菇俗称松树伞、松蘑、肉蘑（东北）。夏、秋季群生或散生于油松（Pinus tabuiaeformis）、马尾松（P.massoiana）、樟子松（P.sylvestris var.mongolica）等林内的地上，与松属植物形成外生菌根，分布于中国（辽、吉、黑、冀、滇）、日本、欧洲及北美［1－2］。至今很难人工离体培养出子实体。目前，人们已对其生物学和生态学特性、驯化栽培进行了初步研究［3－4］，并对其土传病原菌抑菌性和对重金属的耐性进行了研究［5－6］，但对其菌丝体的液体培养和代谢产物方面的研究较少。笔者首次对铆钉菇菌丝体的最佳液体培养条件和铆钉菇菌丝体液体发酵产胞外多糖条件进行了研究［7－8］。在此基础上，本文采用响应面法对铆钉菇液体培养菌丝体所产胞外多糖的提取工艺进行优化，建立了提取工艺的数学回归模型，以确定铆钉菇菌丝体胞外多糖提取工艺的最佳参数，为进一步对其进行结构鉴定和生物活性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基

1.1.1 菌种

铆钉菇（Gomphidius rutilus）购自朝阳市食用菌研究所。

1.1.2 培养基

斜面培养基（PDA培养基）:马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、水1 000 mL，pH自然。

完全培养基:葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.5 g、K2HPO41 g、水1 000 mL，pH自然。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 试剂

葡萄糖、琼脂粉、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、K2HPO4、KCl、CuSO4、CaCl2、Na2HPO4、NaH2PO4、浓硫酸、苯酚、无水乙醇、三氯甲烷、正丁醇均为分析纯或化学纯。

1.2.2 仪器

PL203电子精密天平（梅特勒－托利多仪器有限公司，上海）;DNP－9082电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）;无菌操作台（苏州净化设备有限公司）;UV－2000紫外可见分光光度计（龙尼柯仪器有限公司，上海）;THZ－C－1恒低温气浴摇床（上海丰盟科技材料有限公司）; PHS－3CpH酸度计（上海精密科学仪器有限公司）;HH－S水浴锅（巩义市英峪仪器一厂）;MLS－3750高压灭菌锅（日本三洋）;TDZ5－WS离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种活化

将保存菌种用接种针接入斜面培养基中，25℃恒温培养7 d。

1.3.2 菌丝体液体种子培养

在PDA液体培养基中接入斜面菌体，培养温度为28℃，150 r·min－1摇床培养5～7 d。

1.3.3 胞外多糖液体发酵

将PDA液体培养基中的种子液按10%接种量接入完全培养基中，培养温度为28℃，150 r· min－1摇床培养5～7 d。将发酵液过滤去除菌丝体待用。

1.3.4 胞外多糖提取方法

将10 mL发酵液按试验设计进行处理，在4℃下进行醇析，5 000 r·min－1离心5 min，弃去上清液，沉淀用75%乙醇洗涤（去除还原糖），离心，重复洗涤2次，再离心，沉淀用60℃蒸馏水溶解10 mL，测定其胞外多糖含量。

1.3.5 胞外多糖测定

采用苯酚－硫酸法［9］。

2 结果与分析

2.1 应用响应面法优化铆钉菇胞外多糖提取工艺的试验设计及结果

以提取液中多糖的质量浓度（mg·L－1）为响应值，设计了3因素3水平的响应面试验，试验因素及水平见表1。运用SAS软件得到3因素3水平的响应面试验设计表，共15组实验，响应面设计表及其试验结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表

表2 响应面设计表及其试验结果

2.2 试验结果二次回归模型拟合及方差分析

通过SAS软件分析表2的试验结果，所得回归方程各变量偏回归系数估计值见表3;对实验结果进行方差分析，其结果见表4。

表3 回归方程各变量偏回归系数估计值

表4 试验结果方差分析表

采用二次回归模型所得的回归方程为:

方程中的二次项的系数均为负数，表明方程表征的抛物面开口向下（如图1－图3），有极大值点。

回归方程的决定系数R2=0.959 0，说明回归方程的拟合程度较好，响应值的变化有95.90%来源于所选变量。由表4方差分析得知，回归模型的F－检验极显著（P＜0.01），说明所拟合的二次回归方程合适。此模型能解释反应变量Y变化的95.90%的信息，Y的变异系数为2.010 3。因此，回归方程较好地描述了各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取条件。回归方程的一次项F－检验极显著（P＜0.01），二次项F－检验不显著，交互项F－检验不显著。说明实验所选3个因素的主效应显著，而各因素之间的交互效应较小。从方差分析结果还可以看出:X1（提取温度）对响应值影响效应极显著（P＜0.01），X2（提取时间）对响应值影响效应不显著，X3（料液体积比）对响应值影响效应极显著（P＜0.01），影响顺序依次为:提取温度、料液体积比、提取时间。

根据回归方程，做响应面图（如图1－图3），考察所拟合的响应曲面的形状，分析提取温度、提取时间、料液体积比对多糖提取效果的影响。图1、图2和图3分别为X1和X2、X1和X3、X2和X3因素之间响应面分析的立体图，它们直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响。

图1 X1（提取温度）和X2（提取时间）对多糖提取效果的影响

图2 X1（提取温度）和X3（料液体积比）对多糖提取效果的影响

图3 X2（提取时间）和X3（料液体积比）对多糖提取效果的影响

2.3 响应面的规范分析

运用SAS对回归模型进行规范分析，寻找最优响应区，结果见表5。

表5 响应面的规范分析

由响应面的规范分析可知，回归模型存在稳定点，稳定点的类型为最大值点，此时Y值为284.47。根据表1的对应值和3个自变量的编码公式，可计算出3个主要因素的最佳水平值，分别为X1（提取温度）=6℃、X2（提取时间）=5 h、X3（料液体积比）=1:4.4时，模型预测的多糖浓度最大值为284.47 mg·L－1。

对预测的结果值进行重复性验证试验:取10 mL发酵液，于6℃、料液体积比为1∶4.4的条件下提取多糖，提取时间为5 h，所得平均胞外多糖质量浓度为278.86 mg·L－1。这一结果与预测值基本一致，说明了回归模型的合适性，可用于指导生产实践。

3 结论

应用响应面法对铆钉菇菌丝体胞外多糖的提取工艺进行了优化。铆钉菇菌丝体胞外多糖提取时，料液的体积比对多糖的提取率影响最大，多糖提取率随料液体积比的升高而增加;其次影响多糖提取率的因素是温度，降低温度有利于多糖的提取;提取时间对提取率的影响较小，但提取时间过短会使多糖不能充分析出，而醇沉时间过长可能会使部分多糖降解。获得的各因素最佳水平为:提取温度6℃，提取时间5 h，料液体积比1∶4.4。在此优化条件下，所得胞外多糖的质量浓度为278.86 mg·L－1，比优化前提高了20.40%。

［1］周崇莲，韩桂云，周玉芝，等.几种松树外生菌根真菌的研究［J］.生态学报，1983（2）:103－109.

［2］栾庆书.血红铆钉菇研究现状及开发利用［J］.食用菌，2002（2）:2－3.

［3］韩桂云，齐玉臣，刘忱，等.温度、pH对菌根真菌生长影响的研究［J］.生态学杂志，1993，12（1）:15－19.

［4］计炳生，刘玉静.铆钉菇特性及其驯化栽培初报［J］.食用菌，2001（4）:14－15.

［5］栾庆书，金若忠，云丽丽.血红铆钉菇对土传病原菌抑菌性研究［J］.辽宁林业科技，2005（6）:13－17.

［6］黄艺，黄志基，范玲.铆钉菇对重金属的耐性及其对油松分泌TOC的影响［J］.农业环境科学学报，2006，25 （4）:875－879.

［7］冮洁，兰黎雪，宋红梅.铆钉菇菌丝体液体培养条件及产胞外多糖的研究［J］.安徽农业科学，2008，36（20）: 8543－8545.

［8］冮洁，宋红梅.铆钉菇菌丝体液体培养产胞外多糖条件的研究［J］.食用菌，2009，31（3）:14－17.

［9］宁慧青.不同食用菌多糖含量的比较研究［J］.山西化工，2007，6（3）:16－18.

Optimization of Extraction Conditions of Exopolysaccharides from
Gomphidius Rutilus Gomphidius Rutilus Using Response Surface Methodology

GANG Jie，LIU Kai，LIU Dan－hua
（College of Life Sciences，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）

The extraction motheds for Gomphidius rutilus mycelium exopolysaccharides were optimized by response surface methodology（RSM）.The results showed that the degree of the factors significantly influencing the yield of polysaccharides was in order of extraction temperature，ratio of liquid to solid，extraction times.The optimum extraction conditions are as follows:the temperature 6℃，extraction time 5 hours and ratio of material to liquid 1:4.4.Under these optimum conditions，the exopolysaccharide obtained was 278.86mg/L，improved 20.40%compared with that before optimization.

gomphidius rutilus;mycelium;exopolysaccharides;extraction;response surface methodology

S646

A

1009－315X（2011）03－0241－04

2010－12－20;最后

2011－01－06

辽宁省教育厅项目（2009A155）;中央高校基本科研业务专项资金资助项目（DC10020106）;大连民族学院太阳鸟项目（20090307）。

冮洁（1965－），女，黑龙江齐齐哈尔人，教授，博士，主要从事食品生物技术研究。

（责任编辑 邹永红）