不同底物对海洋混合菌群产氢的影响

刘洪艳

(天津科技大学海洋科学与工程学院天津市海洋资源与化学重点实验室，天津300457)

氢气被认为是未来最理想的清洁能源，其以燃烧值高、清洁无污染、适应范围广等优点越来越受到人们青睐［1］。生物制氢包括微藻制氢、光合细菌制氢和微生物暗发酵制氢3种方式。微生物暗发酵制氢可以分为纯菌种或混合菌群2种方式，混合菌群可利用生物废弃物制氢，相比具有更多优势［2-3］。影响混合菌群产氢效率因素主要有底物、氢气分压、耗氢菌对氢气的利用和培养液pH值［4-5］。目前用于产氢的底物主要包括葡萄糖、蔗糖、淀粉和纤维素等碳水化合物。底物选择主要标准：可用性、成本、碳水化合物含量和生物降解性［6］。变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)根据不同微生物的16S rRNA基因序列中可变区碱基顺序的差异，将来自不同微生物的相同长度扩增片段进行分离，是目前研究微生物遗传多样性最有力的分子生物学技术［7］。目前利用有机废水进行微生物制氢技术多集中在淡水系统，在一些沿海城市，由于淡水资源的缺乏，海水的利用率在逐年加大，加之海水养殖产生的废水(泥)，造成高盐的海水有机废水(泥)大量累积。将单纯的海洋有机废水处理结合生物制氢过程，不仅可以达到环保和资源利用的双重目的，而且使海水生物制氢实用化。混合菌群产氢性质的相关研究是利用海洋有机废水进行产业化产氢的前提。本实验利用DGGE分析不同底物培养条件中产氢混合菌群组成，研究底物种类对从海洋环境中富集的混合菌群产氢影响。为混合菌群应用于海洋有机废水发酵产氢提供相关参数。

1 材料与方法

1.1 产氢混合菌群富集与培养

液体培养基参照Liu等［8］稍有修改，成分如下(g/L)：牛肉膏2，酵母提取物1，NaCl 30，K2HPO41.5，MgCl20.1，FeSO4·7H2O 0.1，L-半胱氨酸0.5，维生素液10 mL/L(VB120.01，VC 0.025，VB20.025，柠檬酸0.02，VB60.05，叶酸0.01)，微量元素液10 mL/L(MnSO4·7H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.05，H3BO30.01，CaCl2·2H2O 0.01，Na2MoO40.01，CoCl2·6H2O 0.2)，刃天青(0.1%)1 mL，pH 7.2。

污泥取自天津海水浴场潮间带。取10 g污泥，加蒸馏水按1∶1稀释，于121℃，10 min热休克处理，室温冷却。在上述液体培养中分别添加葡萄糖，蔗糖，乳糖，淀粉和蛋白胨(20 g/L)，构成含有不同底物的培养基。热处理污泥等量接种到葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉和蛋白胨培养基中，充氮气1 min，120 r/min，37℃培养24 h。按1∶100接种连续培养3次，富集厌氧混合菌群进行发酵产气，连续厌氧发酵48 h。用5 mL注射器定时取样，测定pH值、OD值和氧化还原电位(ORP)。pH值和氧化还原电位采用METTLER TOLEDO酸度计测定，采用岛津分光光度计测定OD值。

1.2 方法

1.2.1 氢气含量测定气体的收集采用排水法。利用气相色谱仪(Agilent，型号6820)测定发酵气体中氢气的含量。氮气做载气，流量为25 mL/min，色谱柱填料为5 A分子筛(60/80目)，柱长2 m，检测器为热导检测器(TCD)。柱温、进样器温度和检测器温度分别为40、200、200℃。

1.2.2 16SrRNA基因PCR扩增以细菌16S rRNA基因V3区通用引物扩增，引物［9］GC-357F：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和517R：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反应体系50 μL反应体系包括以下成分：buffer 5 μL(10×)，引物GC-357F和517R各1 μL(10 μmol/L)，dNTP 1 μL(10 mmol/L)，TaqDNA聚合酶1 μL(5 U/L);模板1 μL;超纯水40 μL。反应程序为94℃4 min;94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30个循环;72℃，10 min。扩增产物经琼脂糖电泳检测，条带单一即可以用做DGGE分离。

1.2.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突变检测系统对PCR产物进行分离。制备8%的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从30%到60%，在150 V的电压下，60℃电泳3 h，采用AgNO3法染色。切取目的条带，利用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(BIOFLUX)提取与纯化DNA，并将回收的DNA作为模板重新扩增进行测序，序列在NCBI数据库中进行BLAST，测序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 不同底物培养条件下混合菌群pH和OD600

不同底物培养条件下混合菌群发酵液终OD600及pH见图1。连续发酵48 h时，测定发酵液OD600值和pH。OD600间接表示混合菌群的生长状态，混合菌群以蔗糖为底物时，OD600值最高。混合菌群以葡萄糖和蔗糖为底物时，发酵液pH相比起始值(7.2)下降明显，发酵液pH的下降是由于细菌厌氧发酵产氢过程中，有机酸是伴随氢气的生成，由于有机酸的积累导致发酵液pH值降低［10］。以蛋白胨为底物的发酵过程中，即代表底物没有碳水化合物只有蛋白质时，发酵液的pH基本没有变化，这表明该组混合菌不能利用蛋白质为能量来源进行发酵。从产气量看，蛋白胨也基本无气体产生，故蛋白胨不适合作发酵底物。

图1 不同底物对混合菌群终pH和OD600的影响Fig.1 The effect of various substrates on finial pH and OD600of mixed culture

2.2 不同底物培养条件下混合菌群的产氢量

高效产氢菌群的显著特征之一是利用多种底物种类进行产氢［11-12］。设置4个底物来代表碳水化合物，包括单糖(葡萄糖)、双糖(乳糖和蔗糖)、多糖(淀粉)，蛋白胨代表底物是蛋白质。图2表示混合菌群在不同底物培养条件下的产氢量。以葡萄糖、蔗糖、淀粉和乳糖为底物时，混合菌群的产氢量依次为(530±20)、(787±24)、(455±35)和(46±5)mL/L(mean±S.E.)。以蛋白胨为底物时，混合菌群基本不产氢，这与文献［4，13］的报道类似，原因可能是蛋白质在转化为氨基酸的过程不能够产氢。

蔗糖为底物时，混合菌群产氢量最高，分析菌群发酵过程中pH、ORP和OD600的变化见图3。发酵液pH在4～14 h之间从6.95急剧下降到4.51，随后仍表现出略微的下降，至38 h时pH基本维持在4.0不变。氧化还原电位(ORP)是表示产氢能力的一个间接指标，在发酵过程中，较高的产氢效率发生在发酵液处于较低的ORP值时，可以作为产氢效率的实时调控指标［14］。在实验中，ORP由初始的20 mV急剧下降为-54 mV，随后虽然有所上升，但在38 h之内一直维持在0 mV以下，44 h后基本维持20 mV不变。由OD600可以看出，在4～38 h之间菌群出现指数增长的趋势，38 h之后菌群不再增长，维持不变，随后略微下降。产气过程主要集中在4～38 h之内，即发酵产氢在38 h时停止。

图2 不同底物对混合菌产氢量的影响Fig.2 Effect of various substrates on hydrogen production of mixed culture

图3 蔗糖为底物培养条件下混合菌pH、ORP和OD600的变化Fig.3 The variation of OD600，pH，ORP of mixed culture using sucrose as substrate

2.3 不同底物培养下混合菌群16S rRNA的PCR扩增

采用16S rRNA基因V3高变异区通用引物357F和517R对基因组DNA进行扩增，在引物357F的5'端添加GC夹以提高扩增片断的分离效果。不同底物发酵菌16S rRNA基因PCR扩增结果见图4。琼脂糖凝胶电泳显示片断大小约200 bp左右，与预期目标一致，PCR样品可以直接用于DGGE实验。

图4 不同底物培养下的混合菌群16S rRNA的PCR扩增产物电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA gene of mixed culture under different substrate conditions

2.4 不同底物培养下的混合菌群16S rRNA的DGGE分析

不同底物培养下，混合菌群组成见图5。将图中标记的条带进行胶回收，并以537F和517R为引物进行PCR扩增，扩增产物测序结果利用BLAST软件进行比对，确定条带DNA片段代表的微生物种属。DGGE电泳中条带位置相同，表明条带所代表的微生物菌属是相同的，条带的强弱不同则表明菌属的数量存在差异。

图5 混合菌群DGGE图谱Fig.5 DGGE profile of 16S rRNA gene of mixed culture

比对结果见表1，在葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉为底物培养时，混合菌群的优势菌条带位置基本相同，表明混合菌群组成基本相同，梭菌属(Clostridium sp.)是发酵液中占优势菌属。以淀粉为底物时，优势条带位置与葡萄糖、蔗糖、乳糖基本相同，但条带3所代表菌属在以淀粉为底物时，其染色密度要明显高于其他底物培养，这表明条带3所代表Bacillus sp.在以淀粉为底物时得到大量富集，Bacillus sp.是一类兼性厌氧菌，对培养条件要求比较宽松，这将促进该混合菌群应用于含淀粉有机废水中。混合菌群以蛋白胨为底物时，不能有效形成优势菌，细菌生长受到抑制。

表1 优势菌16S rRNA基因DGGE图谱条带的比对结果Table 1 Affiliation of denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)fragments determined by 16S rRNA sequence of mixed culture

3 讨论

葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉为底物时，混合菌群利用蔗糖产氢量最高;在没有碳水化合物时，混合菌群不能够利用蛋白胨产氢。

葡萄糖、蔗糖、乳糖和淀粉为底物时，混合菌群16S rRNA基因DGGE电泳分离得到的优势条带位置基本相同，混合菌群中优势菌组成是相同的，丰度最高条带所代表菌株的测序结果是Clostridium sp.。为获得高效产氢菌Clostridium sp.占绝对优势的混合产氢菌群，热休克预处理方法能够起到比较理想效果。

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