广东省一传毒线虫种——胼胝拟毛刺线虫的调查研究

廖 力 迟远丽 邵晓勇 张卫东 徐淼锋 卓 侃 陈其文

(1.珠海出入出境检验检疫局 珠海 519015;2.华南农业大学)

1 前言

传毒线虫是一类重要的植物病原线虫,它们不但可以直接取食危害植物,还可以传播烟草环斑病毒、葡萄扇叶病毒、樱桃锉叶病毒等植物病毒,对植物造成复合侵染,该类线虫一直是国际植物检疫重点关注对象。胼胝拟毛刺线虫 (Paratrichodorus porosus)隶属于毛刺科 (Trichodoridae)拟毛刺属 (Paratrichodorus),是一种植物根系迁移性外寄生线虫,可寄生 100多种植物,并且能传播烟草脆裂病毒[1-4],严重危害植物生长[5-7],包括花卉、果树等许多经济作物,造成严重经济损失,2007年已被我国列为检疫性有害生物。2008年 -2010年,笔者对广东省主要地区的园林植物进行传毒类线虫调查,其中在广州市天河区灰木莲 (Magnoliaceae glanca)上分离到胼胝拟毛刺线虫。本文对该线虫的形态特征和分子数据进行了记述。

2 材料与方法

2.1 线虫样品的采集

采集灰木莲根围土样约 1000g,取样深度约50cm。取样时尽量带有寄主植物的部分根系,装入封口塑料袋,做好标签。

2.2 线虫的分离、杀死与固定

线虫的分离采用过筛法(Brown et al,1988)[8],用 60-65℃水浴 2-3min方法杀死线虫,并用 4%的 FG固定液 (40%甲醛:甘油:蒸馏水 =10:1:89)固定,保存以备鉴定。

2.3 线虫的形态学鉴定

将固定好的线虫制成临时玻片,置于显微镜下观察线虫形态特征并测量形态数据。根据形态特征及测计值进行线虫属、种的鉴定。

分类鉴定主要采用目前国际上普遍接受的Decraemer[5]的毛刺科分类系统,形态测计采用De Man公式,测量与统计采用的英文及缩略词参见文献[9]。

2.4 DNA鉴定

2.4.1 线虫 DNA的提取

采用微量 DNA提取法[10],在载玻片上滴 16μL预冷的WLB液(2.5 mmol/L DTT,1.125%吐温 20,0.025%明胶,2.5倍 PCR缓冲液),挑入 1条线虫,用手术刀将线虫切成多段,迅速吸取含尽量多的线虫片段的悬浮液 8μL,加到含 10μL无菌水的200μl Eppendorf管中,再向管中加入 2μL预冷的2mg/mL蛋白酶 K,使总体积为 20μL,迅速放入 -70℃冰箱 10 min以上。接着将 Eppendorf管置于65℃恒温 60 min,95℃恒温 10 min,最后 12000 g离心 30s。此时即得到DNA悬浮液,-20℃保存备用。

2.4.2 D2D3区扩增

采用 D2A(5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’)和 D3B(5’-TGCGAAGGAACCAGCTACTA-3’)[11]对 28S RNA基因 D2D3区进行扩增。PCR反应体系为:DNA模板 10-20 ng,Ex Taq(5U/μL)0.125μL,10 ×PCR缓冲液 2.5μL,dNTP(2.5 mmol/L)2μL,引物 (10?mol/L)各 1 μL,加无菌水至 25μL。扩增条件为:94℃预变性3min;接着 94℃变性 1min,57℃退火 45s,72℃延伸2min,共 40个循环;72℃延伸 10min。

2.4.3 序列分析

将电泳分离的 PCR产物切胶回收,连接到 pMD 18-T载体,最后转化克隆送交华大基因生物公司测序。序列结果在 NCB I(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行核酸同源性检索,检索程序采取 nucleotide blast,即核酸序列对核酸序列数据库的检索。序列相似性分析采用软件 DNA Star进行。

3 结果与分析

3.1 形态描述

雌虫:热杀死后虫体直,角质层显著膨胀,瘤针向腹面弯。食道球没有缢缩,肠沿食道球背面延伸从背面覆盖食道球。背食道腺核位于食道腺的前部,后亚腹食道腺核略靠后。排泄孔位于食道球前部。双生殖腺对生,卵巢转折,阴门位于虫体中部稍后 (V=54.14,56.21)。在阴门前观察到 2个腹中体孔,阴门后观察到 3个腹中体孔。阴道呈梯形,阴道长占阴门处体宽的 27.42%和 31.1%。阴门骨化结构侧面观呈卵圆形。肛门很靠后,几乎端生。(图1)

雄虫:未发现。

寄主:灰木莲。

形态测量值及与文献记述的比较见表 1。

图 1 胼胝拟毛刺线虫光学显微镜形态图

表 1 胼胝拟毛刺线虫广东种群测量值及与文献记述的比较 (单位:μm)

3.4 D2D3区序列分析

对该线虫群体 28S rRNA的 D2D3区序列进行了扩增和测序,得到了大小为 795bp的片段。该序列与 NCB I登录号为 GU6459341的胼胝拟毛刺线虫序列最为接近,用 ClustalW方法比对发现这两个序列之间的相似性为 99.7%。

4 讨论

胼胝拟毛刺线虫 (Paratrichodorus porosus)最早由Allen(1957)在美国加利福尼亚州芭蕉根部发现,当时命名为 Trichodorus porosus Allen,1957,现在此名为该种线虫的次异名。该种线虫另外 3个次异名是:Paratrichodorus(Nanidorus)porosus(Alen,1957)Siddiqi,1974;Nanidorus porosus(Allen,1957)Sid-diqi,1974和Trichodorus bucriusLordello&Zamith,1958。本次记述的胼胝拟毛刺线虫广州群体的主要形态特征与 Decraemer[5]和 Zheng等[12]的描述基本一致;扩增测序得到的 28S rRNA的 D2D3区序列与NCB I上登录号为 GU6459341的胼胝拟毛刺线虫相似性高达 99.7%,故定为该种。

胼胝拟毛刺线虫主要分布在美国、日本、葡萄牙、伊朗、越南和智利等 10多个国家,在我国仅云南、福建、浙江和广东有分布[13-16];其寄主范围广泛,多达 100多种,包括菠菜、胡萝卜、大豆、豌豆、豇豆、番茄、玉米、梨、桃、香蕉、葡萄、柑橘等。在日本,此线虫还可寄生 5种针叶树和 26种阔叶树。本次在广州天河区的寄主植物灰木莲上分离到胼胝拟毛刺线虫尚属首次报道,它对于相关部门开展针对性的检疫工作,保障广东省园林植物的顺利出口具有积极的意义。

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