＊ ApoCopC与Cu(Ⅱ)相互作用的电化学研究

张辉,郑晓艳,田燕妮,杨斌盛

(山西大学分子科学研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西太原 030006)

＊ApoCopC与Cu(Ⅱ)相互作用的电化学研究

张辉,郑晓艳,田燕妮＊,杨斌盛

(山西大学分子科学研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室,山西太原 030006)

ApoCopC自组装修饰到金电极上,利用循环伏安法研究了apoCopC与Cu(Ⅱ)的相互作用.发现Cu(Ⅱ)在apoCopC/Au电极上出现氧化还原峰,氧化和还原峰电位分别位于0.29 V和0.09 V,形式电位E0′为0.19 V,与裸Au电极相比,峰位发生明显位移.这表明apoCopC吸附在电极表面并且Cu(Ⅱ)与apoCopC结合生成配合物.研究了扫描速率、不同浓度下,Cu(Ⅱ)在apoCopC修饰的金电极上的循环伏安行为.计算出Cu(Ⅱ)在apoCopC修饰的金电极上的表面电子传递系数α=0.5,电子转移速率常数ks=0.75 s-1.

apoCopC;Cu(Ⅱ);循环伏安

铜是生物体必需的微量元素之一,在机体生理活动中起着重要的作用.然而过量铜对生物体是十分有害的[1].因此,细胞内铜的平衡调节具有重要的生理意义.

CopC是由102个氨基酸残基构成的可溶性膜间蛋白,是假单胞菌体内铜调控蛋白之一.NMR、EXAFS和X-ray结构数据表明:CopC蛋白在溶液中呈现由9股β折叠围成的桶状结构,在相距约为30Å的N端和C端分别具有Cu(Ⅱ)和Cu(Ⅰ)结合位点,铜离子通过氧化态的改变实现在两个位点的转移[2-4].到目前为止,研究apoCopC与Cu(Ⅱ)作用,广泛使用的方法是紫外、荧光、EXAFS、NMR等,用电化学方法研究二者作用鲜见报道.本文利用循环伏安法(CV)研究apoCopC与Cu(Ⅱ)的相互作用.同时测定了电子传递系数和电子转移速率常数.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CH I660B电化学工作站(上海辰华仪器公司),金电极为工作电极,铂丝为对电极,饱和甘汞电极为参比电极(vs SCE);KQ118型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)等.

N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、二水氯化铜等均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水.

1.2 蛋白的表达及浓度测定

ApoCopC经诱导、表达以及纯化[5-6].浓度由预测的摩尔消光系数ε280=6 970 L·mol-1·cm-1测定.本文所用的apoCopC蛋白浓度经测定为2.6×10-4mol/L,由杨斌盛研究小组提供.

1.3 修饰电极的预处理及制备

先将金电极依次在0.3μm,0.05μm的氧化铝上抛光,然后用双蒸水超声清洗5 min,接着在1 mol·L-1硫酸溶液中,在0～1.5 V的范围内,重复扫描至循环伏安结果不再改变.取出金电极用双蒸水冲洗,并用N2吹干.随后用微量进样器取6μL apoCopC,均匀地涂布于电极表面.自然干燥后,用缓冲液冲洗以除去未吸附的apoCopC.制备好的电极即为apoCopC/Au电极.所有实验均在室温下进行.

1.4 实验方法

实验采用三电极系统:裸金电极或apoCopC/A u电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE)与铂丝分别作为参比电极和对电极.将制备好的修饰电极浸泡在Cu(Ⅱ)溶液中,搅拌自然富集5 min,取出后用缓冲液冲洗,然后放入p H 7.4的空白 HEPES缓冲溶液中进行循环伏安扫描.扫描电位范围为-0.25～0.6 V.测试底液通高纯氮气15 min除氧,并在整个实验过程中保持氮气气氛.

2 结果与讨论

2.1 Cu2+在apoCopC/Au上的电化学行为

图1(a)是0.3 mmol·L-1Cu2+(p H7.4的10 mmol·L-1HEPES缓冲液)在裸Au电极上的循环伏安响应.(b)和(c)分别是apoCopC/Au电极无Cu2+和自然富集0.3 mmol·L-1的Cu2+5 min之后,在p H7.4的10 mmol·L-1HEPES缓冲溶液中的循环伏安响应.由图1可以看出,在apoCopC/Au电极上,无Cu2+时,没有峰出现.富集Cu2+后,出现氧化还原峰,氧化和还原峰电位分别位于0.29 V和0.09 V,形式电位E0′为0.19 V,与裸Au电极相比,峰位发生明显位移.这些电化学行为表明,apoCopC修饰在金电极上并且Cu2+与apoCopC结合生成Cu2+-CopC配合物.

图1 循环伏安响应.a:裸金电极在Cu2+溶液中;b:apoCopC修饰的金电极在 HEPES缓冲溶液中;c:apoCopC修饰金电极富集Cu2+5 min后在 HEPES缓冲溶液中.扫描速率:100 m V/sFig.1 Cyclic voltammogram s of bare Au electrode in Cu2+solution(a),apoCopC modified Au electrode prior to(b)and after(c)Cu2+accumulation for 5 min in 10 mM HEPES buffer,(p H 7.4),at scan rate of 100 m V/s

2.2 扫描速率对Cu2+在apoCopC/Au电极上峰电流的影响

图2(P120)为不同扫速时Cu2+在apoCopC/Au电极上的循环伏安曲线.由图可见,峰电流随着扫描速率的增大而增大,并与扫描速率呈线性关系.线性回归方程分别为:ipa=1.356 7×10-5v-1.126 36×10-7(r=0.998 87);ipc=8.302 41×10-6v+7.789 63×10-8(r=0.995 76).说明 Cu2+在apoCopC/Au电极上的氧化还原反应是表面控制过程.

2.3 电子转移系数(α)和电子转移速率常数(ks)的获得

通过考察峰电位随扫速变化获得电极反应动力学常数的信息,根据Laviron公式[7],由峰电位Ep与lgv作图,根据其斜率,求得电子转移系数α=0.5.由以下公式可求电子转移速率常数ks:

当v=300 mV/s,ΔE=211 mV,T=298 K时 ,可求得ks=0.75 s-1.

2.4 不同浓度Cu2+在apoCopC/Au电极上的循环伏安响应

Cu2+在apoCopC/Au上的还原峰电流与其浓度的关系如图3(P120)所示.随着Cu2+浓度的增大,峰电流逐渐增大趋于稳定.这是因为在电极表面apoCopC与Cu2+结合,导致蛋白结合位点达到饱和.

2.5 修饰电极的重现性和稳定性

不同时间制备5片apoCopC/Au修饰电极,在0.3 mmol/L Cu2+溶液中峰电流的相对标准偏差(RSD)为3%,说明修饰电极重现性较好.修饰电极在缓冲溶液中贮存9 d后,保持59%的初始电流响应.

图2 不同扫速下富集Cu2+在apoCopC/Au电极上的循环伏安曲线.扫描速率:5～100 mV/s.插入图:峰电流与扫描速率的线性关系.Fig.2 Cyclic voltammograms of Cu2+accumulation at apoCopC/Au electrode with different scan rates of 5～100 m V/s.Inset:plot of Ip vs.v

图3 Cu2+在apoCopC/Au电极上还原峰电流与其浓度的关系(p H7.4的10 mmol/L HEPES缓冲液.扫描速率:100 m V/s)Fig.3 Dependence of the reduction peak currentsof Cu2+on different concentration(10 mmol/L HEPES buffer p H 7.4,at scan rate of 100 m V/s)

3 结论

本文将apoCopC自组装修饰于金电极表面,利用循环伏安法研究了apoCopC与Cu(Ⅱ)相互作用.实验结果表明,apoCopC能修饰在金电极上而且Cu2+与apoCopC结合生成Cu2+-CopC配合物.计算电子转移系数α=0.5,电子转移速率常数ks=0.75 s-1,从而为进一步探究CopC蛋白内Cu(Ⅱ)的运输机理以及细胞周质内蛋白的抗铜作用提供一些有用的理论基础.

[1] Pena M M O,Lee J,Thiele D J.Critical Review a Delicate Balance:Homeostatic Control of Copper Up take and Distribution[J].J N utr,1999,129:1251-1260.

[2] Amesano F,Banci L,Bertini I,et al.Solution Structure of CopC:A Cup redoxin-like Protein Involved in Copper Homeostasis[J].Structure,2002,10:1337-1347.

[3] Amesano F,Banci L,Bertini I,et al.A Redox Switch in CopC:An Intriguing Copper Trafficking Protein that Binds Copper(Ⅰ)and Copper(Ⅱ)at Different Sites[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3814-3819.

[4] Zheng X Y,Pang E G,Li H Q,et al.The Role of Cupric in Maintaining the Structure of CopC[J].Chin Sci Bull,2007,52(6):743-747.

[5] Pang E G,Zhao Y Q,Yang B S.Fluorescence Study on the Interaction Between ApoCopC and Cupric[J].Chin Sci Bull,2005,50(20):2302-2305.

[6] Li H Q,Zhao Y Q,Zheng X Y,et a l.Fluorescence Spectra Study the Perturbations of CopC Native Fold by 2-p-toluidinynaphthalene-6-sulfonate[J].Spectrochim Acta A,2009,70:56-60.

[7] Laviron E.General Exp ression of the Linear Potential Sweep Voltammogram in the Case of Diffusionless Electrochemical Systems[J].J Electroanal Chem,1979,101:1928.

Electrochem ical Characteristics on In teraction between ApoCopC and Cu(Ⅱ)

ZHANG Hui,ZHENG Xiao-yan,TIAN Yan-ni,YANGBin-sheng
(Institute of M olecular Science,Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education Shanxi University,Taiyuan030006,China)

A protein monolayermodified electrode w as prepared by the self-assembly of apoCopC at a gold electrode.The interaction of apoCopC with Cu(Ⅱ)was investigated by cyclic voltammetry at apoCopC-modified gold electrode.The results indicated that the oxidation peak and reduction peak of Cu(Ⅱ)at apoCopC-modified gold electrodewere at 0.29 V and 0.09 V,respectively,in which the formal potential was 0.19 V.The peak potentials of Cu(Ⅱ)at apoCopC-modified electrode were shifted evidently comparing with that at the bare gold electrode.These indicated that apoCopC could adsorb on the electrode firm ly and Cu(Ⅱ)bound to apoCopC to fo rm a comp lex.Moreover,the effects of scan rate,different concentration on the voltammetric behavior of Cu(II)on the apoCopC/Au electrode were studied,and the electron transfer coefficient(α)w as 0.5,electron transfer rate constant(ks)w as 0.75 s-1.

ApoCopC;Cu(Ⅱ);cyclic voltammetry

O657.1

A

0253-2395(2011)01-0118-04＊

2010-07-16;

2010-09-09

山西省回国留学基金;山西省自然科学基金(2006011016);国家自然科学基金(20771068)

张辉(1983-),男,山西运城人,硕士研究生,从事生物电化学的研究.＊通讯联系人:田燕妮,E-mail:tianyann@sxu.edu.cn