HPLC法测定知柏地黄丸中菝葜皂苷元的含量

陈骁勇（江苏盐城市第一人民医院，盐城市 224001）

知柏地黄丸是一种常用中成药，由知母、黄柏、熟地黄等几味药组成，具有滋阴、降火的功效，用于阴虚火旺、潮热盗汗、口干咽痛、耳鸣遗精、小便短赤[1]。为有效、准确的控制知柏地黄丸的质量，笔者以知母皂苷的水解产物菝葜皂苷元为检测指标[2]，通过方法学研究，建立了知柏地黄丸中菝葜皂苷元的含量测定方法。

1 仪器与试药

Aglient 1200型高效液相色谱仪，包括G1311A四元泵高效液相色谱仪、G1322A真空脱气机、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱、Varian 380-LC蒸发光散射检测器、Aglient色谱工作站（美国安捷伦科技有限公司）。

菝葜皂苷元对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0744-200005）；知柏地黄丸（市售，批号：091208、100308、20090501）；甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Aglient C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-水（95∶5）；检测器：蒸发光散射检测器；流速：1 mL·min－1；进样量：20 µL；柱温：25 ℃。理论板数按菝葜皂苷元峰计算应不低于4 000[3]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取菝葜皂苷元对照品适量，加甲醇制成每1.0 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取本品1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20 mL，称定重量，浸泡过夜。超声处理（功率250 W，频率30 kHz）40 min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，蒸干，加水10 mL，盐酸1 mL，加热回流2 h，取出，冷至25℃，边振摇边滴加40%氢氧化钠溶液至溶液颜色由橙黄突变为橙红。用三氯甲烷振摇提取2次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取不含知母的处方药味，按知柏地黄丸的制备工艺，制成阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 线性关系考察

精密量取浓度为0.217 3 mg·mL－1的菝葜皂苷元对照品溶液适量，分别精密吸取2、3、5、10、20 µL，按照“2.1”项下方法进样。以峰面积积分值（Y）的自然对数为纵坐标，以进样量的自然对数（X）为横坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝1.639 5 X+11.548（r＝0.999 7）。结果表明，菝葜皂苷元进样量在0.44～4.35µg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.4 专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20µL，按“2.1”项下色谱条件进样。结果，阴性对照溶液在与菝葜皂苷元对照品相同保留时间处未见色谱峰，故认为阴性对照无干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference solution；B.test solution；C.negative control solution

2.5 精密度试验

精密吸取同一对照品溶液，连续进样6次，每次进样20µL。结果，RSD＝0.78%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、24 h分别测定峰面积。结果，RSD＝1.7%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批号样品适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备，照“2.1”项下色谱条件测定。结果，菝葜皂苷元平均含量为0.296 mg·g－1，RSD＝1.2%，表明该法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的同一批号（批号：20090501，含量：0.296 mg·g－1）供试品约0.8、1.0、1.2 g，各3份，精密称定，分别精密加入“2.2.1”项下的菝葜皂苷元对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按“2.2.2”项下方法制备，照“2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取3个批号的知柏地黄丸适量，按“2.2.2”项下方法制备，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20µL，注入液相色谱仪，照“2.1”项下色谱条件测定，按外标法计算含量，结果见

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recorery tests（n＝9）

表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination for samples（n＝3）

3 讨论

知柏地黄丸是一种常用中成药，是由补阴经典代表方剂六味地黄丸（熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓）加知母、黄柏而成，加强了滋肾阴、清相火的作用。近年来经中医辩证后灵活使用，对慢性咽炎、急性尿路感染等几种疾病也有较好疗效。

知柏地黄丸最主要成分为知母，而知母有效成分为多种甾体皂苷，其皂苷主要为菝葜皂苷元。知母根茎中含甾体皂苷约为6%，有知母皂苷 A1、A2、A3、A4、B1、B2等。菝葜皂苷元为知母中几种主要甾体皂苷的母核皂苷元[4]，因此可通过测定菝葜皂苷元的含量对知母药材的质量进行控制，进而有效、准确地控制知柏地黄丸的质量。

综上所述，本法操作简便，结果准确，重复性好，加样回收率高，可用于知柏地黄丸的质量控制。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：820.

[2] 成旭东，贾晓斌，陈 彦，等.反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定酸枣仁浓缩丸中菝葜皂苷元的含量[J].中国药房，2007，18（3）：204.

[3] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：148.

[4] 沙东旭，陈桂范，张满来.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定知母中菝葜皂苷元的含量[J].药物分析杂志，2005，25（8）：952.