鸡产蛋不同时期蛋壳元素组成及超微结构的研究

孙杰，赵宗胜，赵海璇，李岩，姚秀娟

（石河子大学动物科技学院，石河子832003）

鸡产蛋不同时期蛋壳元素组成及超微结构的研究

孙杰，赵宗胜，赵海璇，李岩，姚秀娟

（石河子大学动物科技学院，石河子832003）

采用高分辨率的扫描电镜和X射线能谱仪测定蛋鸡产蛋不同时期蛋壳的元素组成和超微结构，分析了其结构模式，蛋壳从内到外包括壳膜、锥体层、柱状层、表面晶体层、覆盖层五部分。结果表明：随着蛋进入子宫时间的延长，蛋壳厚度越来越大，蛋壳中钙元素的含量越来越多，蛋壳强度的大小可能与钙含量的多少、壳膜层的厚度、壳膜纤维的粗细、锥体层乳头间的空隙大小以及覆盖层上裂隙的深浅和数量有关。

鸡；蛋壳；元素组成；超微结构

蛋壳是禽蛋的一种天然包装，其便于蛋的保存、运输，而且在蛋的孵化过程中，蛋壳可对胚胎起保护作用，为胚胎提供钙质，帮助胚胎骨骼钙化。蛋壳质量是禽蛋品质的重要特性之一。禽蛋在收集、分级、包装、运输、储藏和加工等环节中，因蛋壳破损所造成的损失率为6%～10%，加之肉眼不能识别的微小裂纹等给禽蛋业所造成的经济损失更为严重。据相关资料估计我国每年因蛋壳破损所造成的经济损失在5亿元以上。蛋壳的质量受多种因素影响，主要有遗传、营养、疾病、年龄等。目前，改善蛋壳质量的研究主要集中在饲养环境与营养供给控制方面等［1－2］。随着现代营养学的发展与环境控制技术水平的提高，禽蛋生产业中单纯因营养供给不足或失衡及环境控制不良导致的蛋壳质量问题已不多见［3］，而高强度生产条件下蛋鸡体内蛋壳形成机制的差异可能是影响蛋壳质量的关键，传统蛋壳质量评价指标包括蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋形指数等结构属性方面，而对物质属性方面研究比较少，元素组成和超微构造是物质属性重要组成部分，对蛋壳质量有必然的影响。因此，开展蛋壳物质属性的研究对减少经济损失，探索蛋壳质量改善调节机制有重要意义。

近年的研究表明，蛋壳沉积形成机制的差异是影响蛋壳质量的关键因素之一［4－5］，而研究蛋壳的超微构造可进一步揭示蛋壳形成机制差异。本文将产蛋不同时期的蛋壳在X射线能谱仪、环境扫描电子显微镜观察所得物质结构属性和超微结构属性结果进行分析，为进一步探寻蛋壳结构对蛋壳质量的影响，了解蛋壳形成的过程及其受控因素，从而提高蛋壳质量的深入研究奠定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选取30只12月龄的健康罗曼蛋鸡，观察每只鸡的产蛋时间和数量［18－19］，连续观察30d；掌握每只鸡的产蛋规律，根据蛋在输卵管各个部位的停留时间，分别在蛋进入子宫前2h、蛋进入子宫前1h、蛋进入子宫后5h、蛋进入子宫后15h和成熟期（自然产出的蛋）收集蛋壳，每个时间段取3个蛋壳。

1.2 方法

1.2.1 蛋壳的采集

分别在蛋进入子宫前2h、1h，蛋进入子宫后5 h、15h和成熟期屠宰鸡，剥取蛋壳，采用磷酸缓冲液（pH＝7.4）清洗蛋壳，然后切片。采用螺旋测微器（0.001mm）测量蛋壳的厚度。

1.2.2 蛋壳的固定

将采集的蛋壳浸泡在2.5%戊二醛溶液（PBS溶液配制）过夜，磷酸缓冲液清洗干净的蛋壳样品；然后依次用40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%酒精，分别浸泡30min左右，将蛋壳细胞组织内的水置换出来，然后用叔丁醇置换乙醇，浸泡3次，每次30min，最后放置冰箱冷冻室（－20℃）中保存以备蛋壳超微结构观察。

1.2.3 蛋壳元素测定及电镜观察

取每个时期的3个蛋壳各1块（约1cm×1cm），外表面向上，拇指轻按，使其碎成小块，用手术刀片沿每块蛋壳以垂直于蛋壳外表面的角度取0.5cm×0.3 cm的小块样，按照外表面、内表面、横断面粘于样品台上，喷金处理，使用扫描电镜观察蛋壳的超微结构。Kevex Sigmatm X射线能谱仪测定蛋壳中元素的相对含量，取平均值为蛋壳元素的相对含量。

2 结果与分析

2.1 蛋壳的厚度

采用螺旋测微器测得蛋进入子宫前2h、蛋进入子宫前1h、蛋进入子宫后5h、蛋进入子宫后15 h和成熟蛋壳的厚度（每个时间段取3个样本），结果见表1。

由表1可见，随着蛋进入子宫的时间延长，蛋壳厚度也越来越大。

表1 不同时间段蛋壳的厚度Tab.1Thickness of eggshell in different times

2.2 蛋壳元素测定

在蛋进入子宫前2h、蛋进入子宫前1h、蛋进入子宫后5h、蛋进入子宫后15h、成熟期分别取3个蛋壳，对蛋壳横断面进行能谱测定分析，结果见表2。

表2 不同时间段蛋壳元素组成Tab.2Elemental composition of eggshell in different times

表2显示：

1）蛋壳中的钙是组成蛋壳的主要元素成分，元素C、P、S是组成蛋壳中蛋白质的重要来源。蛋壳中相对含量较高的元素为碳和钙。

2）蛋进入子宫前2h至蛋进入子宫前1h，钙含量变化的相对增量为10.84（A）；蛋进入子宫前1h至蛋进入子宫后5h，钙含量变化的相对增量为11.45（B）；蛋进入子宫后5h至蛋进入子宫后15h，钙含量变化的相对增量为9.47（C）；蛋进入子宫后15h至蛋排出子宫，钙含量变化的相对增量为2.17（D）。

根据以上4组数据得出钙含量变化的相对增量柱状图，如图1所示。

图1 钙沉积的相对增量柱状图Fig.1The relative difference between the amount of calcium deposition histogram

由图1可见，蛋壳形成过程中钙沉积的量越来越多，其中蛋进入子宫前1h到蛋进入子宫后5h时间段钙沉积的增加量最多，之后钙沉积的增加量逐渐减少，从形态上可以观察到蛋壳由软逐渐变硬。

2.3 蛋壳的超微结构

2.3.1 横断面超微结构

扫描电镜显微结果见图2。

根据成熟蛋壳的显微结构由内到外可将蛋壳分为以下5层：a壳膜（即乳突层），b椎体层，c柱状层，d表面晶体层，e覆盖层170×。

由图2可见，从蛋进入子宫前2h、蛋进入子宫前1h、蛋进入子宫后5h、蛋进入子宫后15h到成熟蛋壳，蛋壳的横断面逐渐变厚，而且椎体层越来越明显，结合前面能谱分析得出，椎体层结构可能对蛋壳结构的稳定性起重要作用，随着钙沉积量增多，蛋壳的稳定性变强，由此说明椎体层的厚度可能与蛋壳的钙沉积量存在一定的联系。

图2 蛋壳横断面的超微结构Fig.2Ultramicrosturtural structure of eggshell transect

2.3.2 外表面超微结构

蛋进入子宫不同时期蛋壳外表面的超微结构见图3。

由图3可见，蛋进入子宫前2h、蛋进入子宫前1h、蛋进入子宫后5h、蛋进入子宫后15h到蛋排出子宫（成熟蛋壳）外表面的裂隙越来越少，而且深浅不一致，裂隙的严重程度和数量可能影响蛋壳的强度，而蛋壳的强度与钙的沉积也有关系，所以裂隙的程度和数量可能与钙沉积有密切关系。更确切的结果需要进一步的试验验证。

图3 蛋壳外表面的超微结构Fig.3Ultramicrosturtural structure of eggshell outer surface

2.3.3 内表面超微结构

蛋进入子宫不同时期蛋壳内表面的超微结构图见图4。

由图4可见，蛋进入子宫前2h、蛋进入子宫前1 h、蛋进入子宫后5h、蛋进入子宫后15h到成熟蛋壳，其内表面上的突起越来越少，纤维层的致密性和有序程度逐渐上升，空隙面积越来越小，表明蛋壳的致密度与蛋壳的强度密切相关。

图4 蛋壳内表面的超微结构Fig.4Ultramicrosturtural structure of eggshell inner surface

3 讨论

蛋鸡排出卵子运行到输卵管峡部开始包被壳膜，在子宫中停留时间最长形成蛋壳［6］。这个过程大致为：首先在壳膜上形成乳突结节，然后以乳突结节为起点形成初级乳突单元，起初初级乳突单元较小，一端附着在壳膜上一端游离，随着初级乳突单元逐渐长成成熟乳突单元，蛋白质纤维和钙混合沉积，即椎体层，蛋壳形成初期椎体层结构比较疏松，椎体层达到一定厚度之后，柱状层便有稳定基础，达到成熟蛋壳的致密结构［7］。

本研究完整地展示了健康罗曼蛋鸡蛋壳形成的不同时期、不同倍数的扫描电镜显微图，壳膜位于蛋壳的最里面，与卵白蛋白直接相连，由蛋白质纤维构成。构成壳膜的蛋白质纤维［8］与蛋壳的表面平行，层叠盘绕，纵横交错，很难分出层次。蛋白质纤维的表面分布许多颗粒状突起和结节，这一研究结果与万秋蓓等［9］、卢汰春等［10］对锦鸡蛋壳和甘雅玲等［11］对马鸡蛋壳的研究结果相一致。结节将蛋白质纤维连接起来，起到固定蛋白质纤维，稳定壳膜结构的作用。椎体层是由椎体组成的，而椎体又由乳突和放射状的锲体构成。随着蛋的成熟，椎体结构越来越明显，锲体呈现多角状，并且直径越来越大。这与Solomon等［12］提出的椎体和椎体层是相吻合的。

本实验研究表明：自然成熟蛋壳的横断面较为坚实、平滑，整体结构致密；未成熟组蛋壳断面凸凹不平，整体结构致密性和平整性差，在不同产蛋时期蛋壳超微结构表现出随着成熟度的不同，其致密程度存在差异，成熟度越高，蛋壳的致密性均有不同程度的增加。在蛋运行的过程中即蛋进入子宫前到进入子宫后，蛋壳的外部形态由软到硬，蛋壳中元素C、P、S的含量逐渐减少，钙的含量逐渐增加，蛋壳的致密性、强度及厚度有明显的增加。从蛋进入子宫不同时期的横切面可看出，蛋壳越来越厚，主要表现在柱状层越来越明显，柱状层是由相互嵌合交联的不规则柱状晶体组成。柱状晶体由次一级的棱柱体构成。

一般认为棱柱体是楔体的垂直延续。在扫描电镜下，蛋壳的柱状层由块状晶体单元组成，具有块状超微结构［13］。这些晶体的存在增加蛋壳的整体性，对稳定蛋壳有一定的影响。有研究［9，11］表明，柱状层断面上有很多可见的无机质突起，突起上有许多大小不一的孔道，称为气孔。大的孔直径约2μm，是胚胎和外界进行气体交换的通道，这与本实验结果相一致。从横切面还可以看出柱状层之外是表面晶体层，随着蛋的成熟，晶体排列越来越紧密，观察蛋进入子宫前1h、2h等早期的横切面，推测晶体层可能是海绵状结构，它为蛋壳的韧性提供了一定的物质基础，至于这些晶体在蛋壳形成的过程中是如何排列的，需要进行更精确的扫描定位。

自然成熟蛋壳的外表面皲裂较少，裂纹深度也较浅，内表面纤维密集，主次分支清晰，层次分布均匀有序，网状结构中多处可见微结节。未成熟蛋壳的外表面皲裂多，裂纹深度略大，局部皲裂已连通成网状，内表面纤维结构松散，结构层次性不佳，排布杂乱无序，主次分支混乱，纤维间有明显裂隙，综合观察发现，蛋壳外表面皲裂数量和深度随蛋壳逐渐成熟呈下降趋势，蛋壳内表面纤维结构随着蛋壳的成熟，分布致密度逐渐增加，纤维裂隙面积逐渐减少，裂隙的严重程度和数量可能影响蛋壳的强度［13，16］。

蛋壳形成后强度的大小可能与蛋壳壳膜的厚度有关，且蛋壳质量主要受蛋壳中钙含量的影响，同时蛋壳超微结构致密程度［15，17］对蛋壳的质量有一定影响。通过对蛋壳形成几个时间点的扫描电镜、能谱元素测定结合蛋壳外部形态的分析，认为形成蛋壳厚度、强度的关键期在蛋进入子宫中5h到15h时间段。

本研究对蛋壳在不同时期其结构变化过程的测定和分析，为更深入的了解蛋壳形成过程，并在此基础上探索蛋壳强度的调控机理及提高蛋壳质量奠定了理论基础。

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Element Composition and Ultramicrosturture of Eggshell in Different Laying Time of Chicken

SUN Jie，ZHAO Zongsheng，ZHAO Haixuan，LI Yan，YAO Xiujuan
（College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

During different laying time of eggshell elements and ultramicrosturtural structure were analyzed by scanning electronmicroscope and X－ray spectrometer.From the inner to the outer shell，the layer are：eggshell membrane，cone layer，column layer，the surface of the crystal layer and cover layer.The results indicated when entering the uterus，the egg has more time extending，the more thick eggshell increasing.The calcium content of eggshell became more and more.The eggshell strength may be related to the calcium content，the thickness of the shell membrane，the thickness fibers of the shell membrane，the size of gap between mammillary and the depth and number of crack in cover layer.

chicken；eggshell；element composition；ultramicrosturtural structure

S831.5；X513

A

1007－7383（2011）06－0706－06

2011－09－13

国家自然科学基金项目（31060305）

孙杰（1974－），女，副教授，从事动物遗传育种与繁殖研究；e－mail：sunjie12＠tom.com。