拮抗菌S37、S44对棉花黄萎病病田土壤酶活性的影响

王飞,赵思峰,李俊华,褚贵新,郭永盛

(石河子大学农学院/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,石河子 832003)

拮抗菌S37、S44对棉花黄萎病病田土壤酶活性的影响

王飞,赵思峰,李俊华,褚贵新,郭永盛

(石河子大学农学院/新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,石河子 832003)

采用室内模拟试验的方法研究了在健康土壤(CK)中单独加入黄萎病菌(V)、混合加入黄萎病菌与拮抗细菌S37(VS37)或S44(VS44)后对棉花生物量和土壤酶活性的影响。研究结果表明:证实了棉花黄萎病菌显著抑制了棉花的生长发育,而拮抗菌处理能够削弱这种抑制作用,使加入棉花黄萎病菌处理的棉花与正常生长的棉花间无显著差异。V、VS37和VS44三个处理对土壤中过氧化氢酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶、蛋白酶活性有明显的促进作用。棉花黄萎病菌显著抑制了土壤多酚氧化酶活性,但拮抗菌有显著的促进作用。本试验研究了苗期至花铃期土壤酶活性的动态变化,发现拮抗菌处理前期对土壤酶活性的促进作用高于后期。磷酸酶活性和蛋白酶活性随着生长发育总体呈先上升然后下降的趋势。

棉花黄萎病;拮抗细菌;土壤酶活性;棉花生物量

新疆是我国最适宜棉区和最大的优质商品棉生产基地,每年种植棉花面积稳定在140万hm2以上,占新疆总耕地面积的1/3[1],在宜棉区,棉花面积占耕地的比例高达70%～80%,且连作现象十分严重[2]。随着连作年限的延长,黄萎病发病率和发病面积逐年增加,目前其已成为新疆棉花高产、稳产的主要障碍之一。因此,控制棉花黄萎病,已成为棉花生产可持续发展的主要任务之一[3-4]。由于黄萎病菌能够在棉花病残体上,甚至直接在土壤中存活达十几年,且菌量可以常年积累[5],虽然国内外在抗病育种、农业防治和化学防治措施等方面做了大量工作,但这些防病措施的效果并不尽人意[6-7]。随着绿色农业、有机农业的兴起,以及生物防治机理的不断明确,利用拮抗菌和以拮抗菌为基础配制的生物有机改良剂防治棉花黄萎病被认为是最具有发展潜力的防治方法之一,已成为目前研究的热点[8]。

目前人们已筛选出很多拮抗菌,有些已经进入大田试验,且表现出对棉花黄萎病有较好的防病效果,从而显示出良好的应用前景。同时,对拮抗菌防治棉花黄萎病的防病机理研究也较为深入。枯草芽孢杆菌可产生细菌素类、酶类、活性蛋白质类、脂肽类、多肽类等多种抑菌物质抑制病原菌的生长[9-10]。同时,可以调节植物根际微生物种群结构和提高植物免疫能力,从而进一步提高了其防治棉花黄萎病的效果[11]。但拮抗菌进入病田土壤后对土壤生物学特性,特别是对土壤酶活性的影响报道较少。

本文旨在了解在土壤中存在棉花黄萎病菌时,研究筛选获得的对棉花黄萎病菌有抑制活性和对棉花黄萎病有较好防治效能的拮抗菌S37和S44对土壤酶活性的影响,从而进一步明确其防治棉花黄萎病的防病机理。

1 材料与方法

1.1 材料

供试土壤:采自石河子大学实验站玉米地,取0～20 cm土层土样共计300 kg。将所取土壤置于阴凉处自然风干,过5 mm筛,充分混匀后备用。土壤质地为壤土,有机质24.73 g/kg,碱解氮64.66 mg/kg,速效磷39.7 mg/kg,速效钾263.43 mg/kg,p H值8.71。

棉花品种:购买于石河子市种子市场,品种为新陆早8号。

拮抗细菌:S37和S44自新疆棉田土壤中分离获得,前期研究证明对黄萎病菌有较好抑制效果,对棉花黄萎病有较好的防病效果[12]。

棉花黄萎病菌Verticillium dahilaeKleb.:由石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室分离保存。

培养基:营养琼脂液体培养基(NA)[13]:牛肉膏3 g、蛋白胨 5 g、NaCl 5 g、葡萄糖 10 g、蒸馏水 1000 mL,p H 7.0～7.2。Czapek培养基[13]:NaNO32.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O、0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖 30.0 g、水 1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌体培养

拮抗细菌培养:将不同生防细菌分别接入装有NA培养基的三角瓶中,28℃200 r/min摇床培养48 h,将其稀释到1×108cfu/mL备用。

棉花黄萎病菌培养:将棉花黄萎病菌转到PDA平板上进行活化,7 d后用打孔器(直径8 mm)取同菌龄的菌饼接种于查氏培养基中,28℃150 r/min摇培7 d,采用血球计数板计数,将孢子浓度稀释到1 ×108cfu/mL,备用。

1.2.2 试验设计

于2009年4月中旬开始,采用室内盆栽模拟试验。将准备好的黄萎病菌和拮抗细菌分别与备用土壤混匀,使得土壤中黄萎病菌接菌量为107个/g土,拮抗菌接菌量为107个/g土。试验共设4个处理,分别为:T1,空白土壤(CK),土壤中既不接拮抗菌也不接黄萎病菌;T2,土壤仅接种棉花黄萎病菌(V);T3,土壤接种棉花黄萎病菌同时接种拮抗细菌S37(VS37);T4,土壤接种棉花黄萎病菌同时接种拮抗细菌S44(VS44)。每个处理设18个重复。本试验采用营养钵规格为12 cm×12 cm,每个营养钵装土600 g,每钵播种6粒棉种,播种后定期浇水,待长出真叶后进行定苗,每钵留2株棉花。分别在定苗后的第15、30、45、60和 75 d取样,每个处理取 3钵,每钵的棉花样品取地上部测定鲜重、干重;每钵的土壤样品拣出肉眼可见的植物根,土壤自然风干,研磨过20目筛后充分混匀用于测定土壤酶活。

1.2.3 土壤酶活性的测定

土壤酶活性的测定方法参见文献[14]中的方法。蔗糖酶活性用3,5-二硝基水杨酸比色法测定,结果以24 h后1 g土壤中的葡萄糖的毫克数表示;脲酶活性用靛酚蓝比色法测定,结果以24 h后1 g土壤中的NH3-N的毫克数表示;碱性磷酸酶活性用磷酸苯二钠比色法测定,结果以2 h后100 g土壤中的P2O5的毫克数表示;蛋白酶活性用茚三酮比色法测定,结果以24 h后1 g土壤中氨基氮的毫克数表示;多酚氧化酶活性用邻苯三酚比色法测定,结果以2 h后1 g土壤中的紫色没食子素的毫克数表示;过氧化氢酶活性用高锰酸钾滴定法测定,结果以单位土重消耗的0.1 mol KMnO4的毫升数表示。

1.2.4 数据统计分析

所得数据均使用Excel 2003及DPS 3.01软件进行分析。棉花生物量及土壤酶活性的测定结果均以3次重复的平均值表示。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌对棉花生物量的影响

拮抗菌处理带菌土壤后对棉花生物量有明显的促进增长的作用(表1、表2)。

由表1和表2可以看出:S37和S44混入带菌土壤后对棉花植株有明显的促生作用。在15 d时棉花鲜重与对照相比分别增加44.3%和47.6%,干重分别增加了51.2%和50.0%;在75d时棉花鲜重与对照相比分别增加了7.8%和8.2%,干重分别增加了5.9%和8.6%。土壤中存在黄萎病菌时,在棉花出苗初期,植株鲜重和干重分别比对照增加了26.7%和26.9%,在棉花生长的中后期,受黄萎病菌的影响,植株鲜重和干重分别比对照减少了2.8%和10.5%。注:字母标记为不同处理间差异(P<0.05)。

表1 不同处理时间对棉花植株鲜重的影响(g/株)Tab.1 The effect of cotton fresh weight under different treatments(g/plant)

表2 不同处理时间对棉花植株干重的影响(g/株)Tab.2 The effect of cotton dry weight under different treatments(g/plant)

注:字母标记为不同处理间差异(P<0.05)。

2.2 拮抗菌对土壤过氧化氢酶活性的影响

拮抗菌处理带菌土壤后对土壤过氧化氢酶活性有明显的促进作用(图1)。

由图1可以看出:在试验期间,有黄萎病菌的处理(V)、接种黄萎病菌同时接种S37(VS37)和接种黄萎病菌同时接种S44(VS44)3个处理的土壤过氧化氢酶活性都要高于CK。从取样期间的变化趋势来看,VS44处理的过氧化氢酶活性在15 d时高于VS37处理,但是从第30 d开始,VS37处理的过氧化氢酶活性要比VS44处理的活性高,2个处理间直到最后一次取样时才表现出显著差异,且呈现出先增加后降低再增加的总体趋势。由此可以得出结论:不仅有益的微生物种群可能导致过氧化氢酶活性的增高,植物病原菌菌群也可能导致过氧化氢酶活性的升高。2株拮抗菌对土壤中过氧化氢酶活性的影响存在差异,S37在生长发育中后期能明显促进过氧化氢酶活性,后期达到显著水平,S44的影响很小。

图1 不同处理土壤过氧化氢酶活性的变化Fig.1 Changes of soil catalase activity with different treatments

图2 不同处理土壤碱性磷酸酶活性的变化Fig.2 Changes of soil alkaline phosphatase activity with different treatments

2.3 拮抗菌对碱性磷酸酶活性的影响

土壤碱性磷酸酶随着棉花生长发育的进程总体呈先上升然后下降的趋势(图2),可能是试验盆钵较小,土壤较少,随着棉花生长,根系及根系分泌物增多,土壤p H降低,土壤碱性磷酸酶下降。2株拮抗菌处理的碱性磷酸酶活性在定苗后45 d前均高于CK和接黄萎病菌的处理,前期拮抗菌的促进作用更加明显。2株拮抗菌处理与接黄萎病菌的处理相比,前期S37对土壤碱性磷酸酶活性的促进作用明显,而后期S44的促进作用明显。

图3 不同处理土壤蔗糖酶活性的变化Fig.3 Changes of sucrase activity with different treatments

2.4 拮抗菌对蔗糖酶活性的影响

由图3可见,对照处理的蔗糖酶活性的影响明显低于其他3个处理。在本试验期间,各个处理的蔗糖酶活性随时间变化的幅度并不明显。这一结果出现的原因可能是人为加入土壤中的棉花黄萎病菌和拮抗菌均增加了土壤原有的微生物群落,对土壤蔗糖酶活性有显著的促进作用。2株拮抗菌处理与接黄萎病菌的处理相比,前期和后期拮抗菌对土壤蔗糖酶活性有显著的促进作用,而中期有抑制作用。

图4 不同处理土壤蛋白酶活性的变化Fig.2 Changes of soil alkaline phosphatase activity with different treatments

2.5 拮抗菌对蛋白酶活性的影响

由图4可见,在棉花苗期至花铃期期间,拮抗菌处理土壤蛋白酶活性在棉花生育进程前期上升,然后逐渐降低。2株拮抗菌对土壤蛋白酶活性有一定的促进作用。

2.6 拮抗菌对多酚氧化酶活性的影响

图5 不同处理土壤多酚氧化酶活性的变化Fig.5 Changes of polyphenol oxidase activity with different treatments

由图5可见,黄萎病菌处理显著地抑制了土壤多酚氧化酶活性,而2株拮抗菌对土壤多酚氧化酶活性有显著促进作用。本研究表明,2种拮抗菌处理的多酚氧化酶活性与对照处理没有显著差异,说明拮抗菌的促进作用与黄萎病菌的抑制作用基本相当。土壤多酚氧化酶活性随时间表现为先降低后增高的趋势。

3 结论

本研究证实了棉花黄萎病菌抑制了棉花的生长发育,研究还表明,试验的拮抗菌处理能够削弱这种抑制作用,另外,拮抗菌对棉花的生长发育有促进作用;对照及拮抗菌的处理在整个试验期间对棉花生物量的差异不显著,说明拮抗菌的促进作用弥补了病原菌的抑制作用。拮抗菌的加入,促进了土壤酶活性的提高,特别是土壤多酚氧化酶、磷酸酶等,但是拮抗菌对不同土壤酶活性的影响力不同,这证明微生物与土壤酶有密切关系。本试验研究了苗期至花铃期土壤酶活性的动态变化,发现拮抗菌处理前期对土壤酶活性的促进作用高于后期。磷酸酶活性和蛋白酶活性在棉花生育进程前期上升,然后逐渐降低,其他酶活性变化规律不明显。

4 讨论

棉花黄萎病菌通过限制水分在棉花体内的正常运输对棉花的生长发育产生抑制作用,而拮抗菌处理能够削弱这种抑制作用,这可能是拮抗菌抑制了病原菌的生长,限制其危害棉花生长,也可能是拮抗菌促进棉花种子发芽、根系生长,有利于棉花抗病和生物量增加[12]。对照及拮抗菌的处理在整个试验期间对棉花生物量的差异不显著,说明拮抗菌的促进作用弥补了病原菌的抑制作用。这一试验结果与张慧等[11]的研究结果部分类似,即对照与两种拮抗菌处理之间的植株鲜重无显著差异。

土壤酶包括游离酶、胞内酶和胞外酶,主要来自微生物和植物根系的分泌作用[15]。本研究结果验证了微生物对土壤酶的作用,即添加植物病原菌和拮抗菌增加了土壤微生物的数量和种类,从而增加了它们产生酶及其死亡后释放酶的能力,对土壤酶活性有增加作用。王曙光等[16]研究表明,接种AM真菌反而使菌根际、菌丝际的土壤中性磷酸酶含量下降,而本研究结果与之相反,接种棉花黄萎病菌后土壤磷酸酶活性是增加的,这可能是AM真菌是内生真菌的原因。

杨万勤等[17]的研究结果表明土壤酶活性的季节变化规律很明显,但不同的酶类,其变化规律不同,本研究结果证明了这一观点。刘建国等[18]研究表明,棉田不同的土壤酶活性在棉花生育时期呈现不同的变化规律。本研究中磷酸酶活性变化与刘建国等[18]结果一致,但蛋白酶活性与之相反。土壤酶活性的时空动态变化是土壤酶对土壤理化性质、土壤类型、植被、气候等综合环境因素的响应,土壤酶活性在不同生态系统中的时空动态受到土壤酶学研究工作者的重视[19],这对理解土壤物质分解、循环状况以及微生物学过程有着重要作用。在稳定的环境中研究拮抗菌对棉花整个生育时期土壤酶活性的动态影响,可为棉花黄萎病的生物防治和土壤肥力的可持续利用提供理论依据,这还需要做进一步研究。

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Effects of Antagonism Bacteria on Soil Enzyme Activities in CottonVerticillium dahliaeField

WANG Fei,ZHAO Sifeng,LI Junhua,CHU Guixin,GUO Yongsheng
(College of Agriculture,Shihezi University/The Key Laboratory of Oasis Eco-Agriculture,Xinjiang Production and Construction Group,Shihezi 832003,China)

The influences of different antagonism bacteria on the soil enzyme activities and cotton biomass were evaluated with a pot experiment under greenhouse conditions.Four treatments were carried out.They were health soil(CK),CKadded withVerticillium dahliaeKleb(V),V added with antagonism bacteria S37(VS37)and V added with antagonism bacteria S44(VS44).The results showed that cotton biomass measured as plant fresh and dry weight was significantly inhibited withVerticillium dahliaeKleb,but significantly promoted with antagonism bacteria,so that cotton could grow normally with the treatments of VS37and VS44.The three treatments of V,VS37,VS44 could improve soil enzyme activities of catalase,alkaline phosphatase,sucrase,protease and urease.The soil polyphenol oxidase were significantly inhibited withVerticillium dahliaeKleb,but significantly promoted with antagonism bacteria.The changes of soil enzyme activities were studied from cotton seeding to bolling.The activities were higher in seeding than in bolling with antagonism bacteria.The activities of alkaline phosphatase and protease increased in seeding but decreased in bolling.

cottonVerticilliumWilt;antagonism bacteria;soil enzyme activities;cotton biomass

S144.9;S154.2

A

1007-7383(2011)02-0158-05

2010-03-20

国家公益性行业(农业)科研专项(200803031),国家科技支撑计划项目(2007BAC17B06),农业部“948”重大项目(2006-G62)

王飞(1984-),女,硕士生,专业方向为新型肥料研制与应用;e-mail:yuweiba207@163.com。

李俊华(1972-),男,副教授,从事有机肥与植物土传病害生物防治等方面研究;e-mail:ljhshihezi@sina.com。