用转化BHK-21细胞测定口蹄疫A、O和Asia-I型病毒TCID50与LD50毒价对比试验

薛 英 ；王玉红 ；黄 炯 ；潘晓梅 ；徐亚萍 ；刘 宏 ；张 莉 ；田晓敏

（1.新疆畜牧科学院兽医所，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830000)

口蹄疫(FMD)是哺乳动物的一种高度接触性传染病，该病对易感动物具有严重的潜在经济危害[1]，造成巨大经济损失。安全有效的疫苗是预防和控制该病的关键所在。口蹄疫灭活疫苗具有安全、免疫效果好、使用简便等特点，已在全国广泛推广使用。口蹄疫灭活疫苗在半成品及成品检验中均需进行病毒含量测定，目前，我国FMD疫苗生产和检验依然采用乳鼠测毒法，即LD测定，该方法一方面需要历时4～5d连续观察才能得到结果，另一方面测定的结果有时可能还受到乳鼠质量或个体差异或意外死亡的影响，使检测结果不准确，更甚者需重新检验。所以该检验方法较为繁琐，费时费力，严重影响了检验效率，使检验结果远滞后于生产，影响了生产效率。口蹄疫病毒可使BHK-21细胞发生明显病变，用检测BHK-21细胞的TCID代替LD，将使检验工作更为简便且节约成本。本实验室前两年参照谢庆阁主编的《口蹄疫》（2004）[2]中的测定方法，用正常的BHK-21细胞测定TCID50，结果由于普通BHK-21细胞在达到判定时间的时候，大量细胞已老化脱落，造成后期染色结果不准确，与乳鼠测毒法结果差异较大。后来从别的实验室馈赠，引进了转化BHK-21细胞，该细胞经分子生物学改造，在正常的BHK-21细胞的基因中添加了T7聚合酶基因，增加了对口蹄疫病毒的敏感性，在该细胞接毒后2～3h即可发生病变，8h左右即可对病变进行判定，这样就大大节约了检验时间及人力物力。本试验对本厂生产的O型病毒10个样、Asia-I型病毒7个样和A型病毒4个样进行TCID50与LD50进行测定，数据显示两者的测定结果较为一致，目前的试验证明用转化BHK-21细胞测定TCID50是可行的，是一种省时省力的好方法。

1材料和方法

1.1 器材和设备

96孔微量板（BD,美国产），100～1000ul、20～200ul微量可调式移液器和50～250ul连续式移液器（Finnpipette，芬兰产）；CO2培养箱（Hearcell,德国产），快速混匀器。1ml注射器，1ml吸管，10ml吸管。

实验动物：3～4日龄乳鼠由本厂动供部采供。

细胞：新疆农业大学馈赠，本公司实验室自供。

病毒液：口蹄疫O型、Asia I型病毒由生产车间供应。口蹄疫A型病毒由新疆畜牧科学院兽医所提供。

1.2方法

病毒培养：按照《牛口蹄疫Asia-I-O型双价灭活疫苗生产工艺规程》[2]进行生产。

LD50/0.2ml测定：按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版）[3]规定的方法进行试验。

TCID50/0.1ml测定:将病毒样品连续10倍稀释10-1～10-9，取 10-6～10-94 个稀释度，接种转化 BHK-21 细胞单层的96孔细胞板中，每稀释度接种4孔，每孔0.1ml，37℃吸附1hr，再加入2%新生牛血清的细胞培养液，同时一定要做细胞对照。然后37℃5%CO2的培养箱中培养，8h后观察细胞病变，根据出现细胞病变的孔数计算TCID50。

图1 A型病毒稀释10-5的细胞病变（12hr）

2 结果

3.1 转化BHK-21细胞病变特征

在实际用96孔板测定病毒含量前，对转化BHK-21细胞进行接毒试验，摸索该细胞的病变特征，为后期的病毒含量测定作准备。以下是不同滴度口蹄疫A型病毒在转化BHK-21细胞上12h的病变情况，见图1、图2。

图2 正常细胞对照

3.2 测毒结果（见表1）

表1 病毒样品的LD50/0.2ml和TCID50/0.1ml结果

4 讨 论

转化BHK-21细胞与正常的BHK-21细胞在形态上有明显的不同，正常BHK-21细胞成梭形，转化BHK-21细胞形态偏圆[4]。正常BHK-21细胞接毒后病变是：细胞圆缩，聚团呈葡萄串样，而转化BHK-21细胞病变是：细胞变圆，变大、空泡化不聚团，病变严重时细胞崩解为碎片，死亡。

通过表1的试验数据，共计21个样品，其中结果完全相同的有16个，既有76.2%（16/21）的一致性，并且有偏差的数据，偏差范围在0.25～0.5以内，所以目前的试验证明用转化BHK-21细胞测定TCID50是可行的，而且数据在准确度上非常接近乳鼠测定法，目前数据有限还需要进一步验证。另外笔者还认为，在观察病变的过程中一定要与细胞对照仔细对比观察，认真判定。对病变认知程度不同的人所判定的结果就有较大的误差。所以用转化BHK-21细胞测定TCID50是可行的，但对判定者的要求较高。

[1]殷 震，刘景华.动物病毒学(第二版)[M].北京:科学出版社，1997.

[2]谢庆阁等.口蹄疫[M].2004:226-227.

[3]《中华人民共和国兽用生物制品规程》（2000年版）

[4]刘光清，刘在新，谢庆阁.口蹄疫病毒持续性感染形成原因的探讨[J].中国兽医科技，2003，33（4）：35-39.