四川引种甜叶菊的糖苷含量变异及优良单株筛选

杨文婷，蔡乾蓉，徐应文，刘 千，吴 卫

（四川农业大学农学院，雅安 625014）

甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni），简称甜菊，为菊科甜叶菊属多年生草本植物，原产南美巴拉圭一带，1976年在我国引种试种成功[1]。甜叶菊富含糖苷类物质，其糖苷具有高甜度（为蔗糖250～450倍）、低热量（仅为蔗糖的1/300）的特点，被誉为继甘蔗、甜菜之后的世界第三大糖源。甜叶菊还具有一定的药理作用，对糖尿病、心脏病和高血压等有较好的疗效，逐渐引起人们的关注和重视，现已广泛应用于保键饮料、低热量食品和医药行业中。

一般认为甜叶菊中含有8种以上糖苷成分[2]，其中，Stevioside（简称St苷）和Rebaudioside（简称RA苷）占80%以上。St苷的甜度为蔗糖的250～300倍，有后苦味，而RA苷的甜度为蔗糖350～450倍，且味质好，口感最接近于蔗糖，因而RA苷含量高的甜叶菊原料备受青睐；同时，如果原料中RA和St苷含量接近会给工业生产中的分离纯化带来困难，提高成本，所以目前甜叶菊育种工作主要聚焦于高RA苷含量、高RA/St比例的优质的RA型糖用品种的培育。但近年来国外有研究表明，St苷具有降低Ⅱ型糖尿病血糖浓度和控制高血压的作用[3、4]，并且St苷还具有很好的抗癌活性[5]，有望开发成为新一代天然抗癌制剂，因此高St含量的药用型甜叶菊良种的选育也应是甜叶菊育种工作的一个潜在方向。

甜叶菊为自交不亲和的异花授粉植物，采用种子繁殖后代性状分离严重，因而生产上多采用无性扦插繁殖。近年来，四川开始大面积引种甜叶菊，但引种的RA型甜叶菊良种经1～2年的扦插繁殖后，田间植株在叶形、叶色及株形长势上表现出明显差异，出现RA苷普遍下降，RA/St比例偏小等问题。本文对引种至四川的甜叶菊无性繁殖材料，在田间随机选择46个单株（按其田间表型特征分可为6类）进行了RA和St糖苷含量测定，并进行了聚类分析，一方面旨在探讨RA和St糖苷含量与甜叶菊植株的田间表型特征的关联；另一方面试图筛选出高RA苷含量、高RA/St比例的糖用型或高St苷含量的药用型甜叶菊单株材料，为不同用途的甜叶菊新品种的选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料、仪器与试剂

材料：甜叶菊无性繁殖种苗由成都华高集团提供，经四川农业大学吴卫教授鉴定为菊科甜叶菊属甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）。于2008年3月扦插育苗，4月移栽至四川农业大学教学科研农场，株行距20cm×40cm，2008年10月割去地上部分，田间自然越冬，次年继续萌芽生长，加强田间管理，于现蕾初期田间随机选取46份甜叶菊单株材料，考察植株上部第4～7叶的叶长和叶宽（叶片最宽处测量值），每株各测定30片叶。并采集其植株上部第4～7位的鲜叶在120℃下杀青10min，后80℃烘干、粉碎待用。

46份甜叶菊单株材料按叶形、叶色、植株被毛情况等表型特征可分为A、B、C、D、E和F 6类，见表1。其中，倒披针形的叶长/叶宽为2.5～3.4，细柳叶形叶长/叶宽为4.0～5.5，阔椭圆形叶长/叶宽为2.1～2.8，长椭圆形叶长/叶宽为 2.7～3.9。

仪器设备：上海一恒科技有限公司HWS 28型电热恒温水浴锅、Thermo BR4i型冷冻离心机、Sartorius CP225 D型电子天平、HS6150 D型超声清洗器、Millipore Mill-Q型超纯水系统、Agilent公司1100型高效液相色谱仪（含脱气机、四元梯度泵、自动进样器进样、柱温箱、DA D检测器）等。

试剂：RA苷标准品为日本和光纯药业株式会社制，其纯度≥97.4%；St苷标准品为成都曼思特对照品制，其纯度≥95.5%；乙腈为色谱纯；乙醇、Ca（OH）2、FeSO·7H2O 等为分析纯。

表1 甜叶菊单株材料的表型类型及性状表现

1.2 试验方法

1.2.1 单株糖苷提取方法 称取甜叶菊粉末1g于50mL离心管中，加入蒸馏水40mL，盖紧离心管盖，80℃下恒温水浴浸提 3h，每隔 1h搅拌 1次。 后按 5∶3的比例加入 Ca（OH）2和 FeSO4·7H2O[6]，80℃下静置沉淀 2h，再3000r/min离心10min，取上清液定容至50mL，过0.45μm滤膜，待测。每单株两次重复。

1.2.2 甜叶菊糖苷种类和含量的检测 甜叶菊糖苷种类和含量的检测采用高效液相色谱（HPLC）法。甜叶菊RA和St糖苷的含量通过HPLC外标定量法计算，RA和St糖苷的量分别以RA和St糖苷占干叶重的百分数表示。

标准溶液的配制：分别称取RA苷标准品1.100g和St苷标准品1.020g于10mL容量瓶中，用V乙腈∶V水=75∶25定容至刻度，再超声5min中，得RA苷和St苷标准溶液。

色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna NH2 柱，4.6×250mm；流动相：V乙腈∶V水=75∶25；流速：1.2mL/min；柱温：30℃；检测波长：205nm；进样量：10μL。

1.3 数据处理

由色谱工作站计算样品中RA和St糖苷含量。在此基础上，计算St苷和RA苷总量St+RA，RA苷占总苷的比值RA/（St+RA），St苷占总苷的比值St/（St+RA）以及RA苷与St苷的比值RA/St，所有数据统计采用Excel软件进行。并根据RA和St糖苷含量，利用DPS v7.05统计分析软件，采用欧式遗传距离，WPGMA聚类分析重建46个甜菊单株材料的分类关系。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线 分别取RA和St苷标准溶液5、10、15、20、25μL进样。由色谱工作站处理数据，以RA和St苷质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制得两条标准曲线，RA和St苷相应的回归方程分别为y=0.0003x+0.0084，r2=0.9999；y=0.0005x+0.0539，r2=0.9997。 RA、St苷对照品色谱图见图 1 A、B。

2.1.2 精密度试验 分别精密吸取RA和St苷标准溶液10μL，重复进样5次，测得RA和St苷相对标准偏差（RSD）分别为0.98%、1.24%，表明仪器进样精密度良好。

2.1.3 稳定性试验 分别精密吸取RA和St苷标准溶液及试验样品10μL，分别在6、12、24、48、72 h进样测定，标准品的相对标准偏差（RSD）分别为1.13%、1.56%；样品的相对标准偏差（RSD）为1.69%。结果表明，标准品及样品在72 h内有良好的稳定性。

2.1.4 重现性试验 取同一份甜叶菊材料，按1.2.1的提取方法分别同时配制6份，样液精密进样10μL，测得相对标准偏差（RSD）分别为2.53%，表明该方法的重现性较好。

2.2 甜叶菊单株RA和St糖苷含量

甜叶菊单株RA和St糖苷测定结果列于表2，HPLC色谱图见图1 C、D。从表中可以看出，甜叶菊单株间RA和St糖苷含量差异明显。46个单株间RA糖苷含量的变幅为0～10.56%，St糖苷含量的变幅为2.90%～20.97%，St+RA 变幅为 4.72%～21.74%，RA/（St+RA）变幅为 0～0.758，St/（St+RA）变幅为 0.242～1.000，RA/St变幅为0～3.139。A、C和E表型的单株间RA和St苷含量变幅相对较小，B、D和F表型的单株间RA和St苷含量变幅相对较大，如B类表型的单株间RA和St苷含量变幅分别为1.82%～10.56%和2.90%～16.44%，说明田间表型特性相似的植株其RA和St糖苷的含量也可能存在较大差别，甜叶菊的表型类型分类并不能很好地反应甜叶菊内在糖苷含量的差异，甜叶菊类型的确定需根据其有用的糖苷类成分含量进行划分才更科学合理。

2.3 聚类分析

根据甜叶菊单株St和RA苷含量对46份甜叶菊材料采用WPGMA法聚类，由系统聚类图可以看出，46个甜叶菊单株可明显地分为两支。第一支以SR1-1～SR1-8、SR9-1～SR9-3等为主，所有单株的RA/St值均小于1，是St苷含量高于RA苷含量的类型；第二支以SR3-1～SR3-9及SR2-1、SR2-2等为主，其除SR2-4和SR27之外，所有单株的RA/St值均大于1，是RA苷含量高于St苷含量的类型。

以遗传距离3.21为阈值时，可以将46份甜叶菊单株材料分为9类（Ⅰ～Ⅸ），见图左边的标识。其中，Ⅰ和Ⅲ类材料与其表型类别有一定关系，分别与基于表型划分的A和E类材料相对应（见表1、图2）；Ⅶ类材料包括了表型类别上的C类所有单株，另外还包括SR2-3、SR27、SR2-5；其余基于表型为B，D和F的材料与基于RA和St含量的聚类结果关系不明显，无特定规律地分布在Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅷ和Ⅸ类中。值得一提的是，SR2-1、SR2-2、SR24及SR25聚为Ⅷ类，这些植株的RA苷含量＞9.55%，是46份单株材料中RA苷含量和RA/ST比例最高的类型；Ⅵ类则只包括SR5和SR6，二者均只含St苷，且St苷含量分别高达20.97%和20.38%。

3 小结与讨论

甜叶菊基于RA和St糖苷含量的聚类结果与依据甜叶菊田间表型特征的分类不尽一致，即田间表型性状相似的单株其RA和St糖苷含量却不尽相同，甚至相差甚远，提示甜叶菊RA和St糖苷的代谢与其植株的叶形、叶色等表型特征可能无直接关联，在甜叶菊良种选育的过程中进行单株RA和St糖苷的测定是必要的，不能简单依据植株表型特征来优选单株。

钱愉等的研究表明RA型良种单株无性系的叶片大小和含苷量均存在显著差异，RA含量变幅为4.5%～12.2%，并从RA含量为9.10%的良种单株无性系中选出RA含量为10.15%～12.15%的单株[7]；韩玉林等从3个甜叶菊优良品系的自然辅助人工授粉结实得到的13株单株中筛选得到2个优良单株，RA苷的含量分别为13.34%和12.30%[8]。本试验对引种至四川的甜叶菊材料随机选择46个单株进行RA和St糖苷含量测定，发现RA苷含量的变幅为0～10.56%，略低于已有的报道，估计与试验材料有关，也可能与四川的气候环境与前述研究所处环境不尽相同有关。

黄应森提出的甜叶菊分型标准认为RA型甜叶菊的RA/St值应大于1.8[9]，本试验中符合RA/St＞1.8的RA 型甜叶菊单株材料共有 4 份，即 SR2-1、SR2-2、SR3-4、SR25。 除 SR3-4 之外，SR2-1、SR2-2、SR25 的 RA苷含量为9.55%～10.56%，SR3-4的RA苷含量也高达7.55%，比平均高出2.41%。46份单株中未发现只含RA苷不含St苷的RA型单株。但本试验发现了完全检测不到RA苷的St型甜叶菊，如SR5和SR6单株，且其含量分别高达20.97%和20.38%。接下来我们将对SR2-1、SR2-2、SR25及SR5、SR6这5个优良单株进行进一步的扩繁选育，以期筛选出适合四川地区种植的优良RA型糖用或St型药用甜叶菊新品系。

[1]舒世珍，等.中国甜叶菊栽培及应用技术 [M].北京:农业出版社，1994:1-3.

[2]Antonio S Dacome,Cleuza C da Silva,Cecília E M da Costa,et al.Sweet diterpenic glycosides balance of a new cultivar of Stevia rebaudiana （Bert.）Bertoni:Isolation and quantitative distribution by chromatographic,spectroscopic,and electrophoretic methods[J].Process Biochemistry,2005,40（11）:3587-3594.

[3]Hsieh M H,Chan P,Sue Y M,et al.Efficacy and tolerability of oral stevioside in patients with mild essential hypertension twoyear,randomized,placebo-controlled study[J].Clin.Ther.2003,25:2797-2808.

[4]Gregersen S,Jeppesen P B,Holst J J,et al.Antihyperglycemic effects of stevioside in type 2 diabetic subjects[J].Metab.Clin.Exp.2004,53:73-76.

[5]Midori Takasaki,Takao Konoshima,Mutsuo Kozuka,et al.Cancer preventive agents Part 8:Chemopreventive effects of stevioside and related compounds[J].Bioorganic&Medicinal Chemistry,2009,17（2）:600-605.

[6]刘宗林，彭义交，郭洋，等.甜叶菊苷的提取与结晶工艺研究[J].食品科学，2002（8）:99-100

[7]黄应森，郭爱桂，钱愉，等.甜菊含甙量的变异及R-A型良种的选育[J].植物资源与环境学报，1995（3）:28-32.

[8]韩玉林，黄苏珍，张坚勇，等.甜菊良种的单株选育[J].植物资源与环境学报，2002（1）:25-28.

[9]黄应森.中国甜菊和甜菊糖甙的分型研究[J].中国糖料，1999（4）:26-29.