几丁糖和聚乳酸防粘连凝胶及玻璃酸钠预防硬膜外瘢痕粘连的实验研究

武宜亮 新疆医科大学30期研究生 乌鲁木齐830000

李建江 黄异飞 吴彦生 杨 涛 张 斌 新疆医科大学附属中医医院脊柱二科

椎板切除是腰椎后路手术常见的减压方式及手术入路途径，术后必然会形成硬脊膜瘢痕粘连，过量的硬膜外瘢痕粘连的形成可引起硬膜和神经根的压迫及牵拉，严重时可导致椎板切除后的腰腿痛等症状复发，影响手术效果。而其所产生的典型临床症状，是下腰痛伴有或不伴有下肢放射痛，被称为下腰椎手术失败综合征(FBSS)。目前，临床上常应用玻璃酸钠以预防硬膜外粘连的发生。几丁糖及聚乳酸防粘连凝胶也具有类似功效被运用于临床，但其应用于椎板切除术后防止硬膜外粘连还缺乏较科学的实验支持，或其疗效尚缺少十分确凿的证据。本实验旨在通过对预防椎板切除后硬膜外瘢痕粘连的作用效果观察及相关机制的探讨，为临床应用几丁糖与聚乳酸防粘凝胶提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料 几丁糖(上海其胜药物有限公司生产)，聚乳酸防粘连凝胶(石家庄市瑞诺生物医学材料有限公司生产)，玻璃酸钠(山东正大福瑞达制药有限公司生产)。

1.2 动物分组 清洁级成年雄性SD大鼠72只，体重250g±10g。根据完全随机化设计原则按随机数字表法随机分几丁糖组、聚乳酸防粘连凝胶组、玻璃酸钠组和生理盐水对照组，每组18只。每组再按随机数字表法随机分为术后4、8、12周3个时间点组，每组6只。

1.3 手术方法 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取腰背部正中切口，长约3cm，切开皮肤、皮下组织，向两侧剥离骶棘肌，暴露L1-2椎板，咬除L1-2全椎板，造成0.4cm×1.0cm大小的椎板缺损，切除部分黄韧带，保留完整硬膜，纱布轻拭干净并于硬膜外及两侧神经根表面涂布相应药物(聚乳酸待成膜)后逐层缝合肌肉及皮肤，适宜温度下促进大鼠麻醉清醒，而后回笼常规饲养。

1.4 观察项目

1.4.1 大体观察 四组分别于术后4、8、12周各取6只大鼠处死，对术段脊柱上三分之一标本按照Lawson标准［1］行粘连程度评分。0度:硬膜与瘢痕组织无明显粘连;Ⅰ度:硬膜与瘢痕组织有散在粘连，但易于分离;Ⅱ度:硬膜与瘢痕广泛粘连，但可钝性分离而不损伤硬膜;Ⅲ度:硬膜与瘢痕组织粘连致密，需锐性分离。

1.4.2 组织学观察 四组分别于术后4、8、12周大体观察同时，将术段脊柱连同骶棘肌整块取出并作精细修整，并将其以10%甲醛溶液固定24小时，而后用微型薄锯垂直于脊柱纵轴取未经肉眼观察的中三分之一标本放入10%甲醛溶液中再次固定，3天后取出予以10%盐酸脱钙1周，而后石蜡包埋，取3μm超薄切片HE染色后光镜观察，按改良Nussbaum标准［2］行组织学评分:0.5分:硬膜外瘢痕粘连面积＜25%，或硬膜外胶原纤维稀疏，或瘢痕无明显侧后方延伸;1分:硬膜外瘢痕粘连面积＜50%，或硬膜外胶原较致密，或瘢痕向侧方延伸至神经根和椎板间隙之间或部分嵌入椎板间隙，但未压迫硬膜囊;1.5分:硬膜外瘢痕粘连面积≥50%，或胶原致密，或瘢痕包绕，延伸到一侧或双侧神经根，嵌入椎板间隙，硬膜囊或脊髓受压。每项1.5分，合计4.5分，并以此分级:Ⅰ级:0.5≤评分≤1.5;Ⅱ级:2.0≤评分≤3.0;Ⅲ级:3.5≤评分≤4.5。

1.4.3 透射电镜观察 术后12周在取光镜标本时于四组各取3只大鼠L1-2标本的硬膜外瘢痕组织，经戊二醛、四氧化锇固定，丙酮脱水，EPON812包埋，醋酸铀及枸椽酸铅双重染色，H-600型透射电镜观察纤维细胞的内部结构(高尔基体、核糖体、线粒体及内质网等)，重点观察病变处靠近硬膜外纤维细胞。

2 结果

2.1 硬膜外瘢痕组织粘连大体观察

2.1.1 术后4周 术后4周聚乳酸防粘连凝胶组见中等量瘢痕组织充填椎板缺损区，硬膜囊光滑，瘢痕与硬膜无粘连。几丁糖组见中等量瘢痕组织充填椎板缺损区，质地较致密，大部分标本未见椎板缺损处瘢痕组织与硬膜囊粘连，少数标本有散在粘连并易于钝性分离。玻璃酸钠组见中等量瘢痕组织充填椎板缺损区，硬膜囊光滑，瘢痕与硬膜无粘连。三组评分与生理盐水组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);玻璃酸钠组、几丁糖及聚乳酸防粘连凝胶组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

表1 四组术后4周硬膜外瘢痕粘连大体观察 只

2.1.2 术后8周 术后8周聚乳酸防粘连凝胶组见瘢痕组织覆盖椎板缺损区，质地硬，大部分标本硬膜囊光滑，少数标本瘢痕与硬膜囊存在散在粘连，但易于钝性分离。几丁糖组见瘢痕组织覆盖椎板缺损区，质地硬，与硬膜粘连较致密，但可钝性分离。玻璃酸钠组见瘢痕组织覆盖椎板缺损区，质地较硬，与硬膜粘连致密，少数标本可钝性分离。四组评分比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，聚乳酸防粘连凝胶组优于几丁糖组、玻璃酸钠组及生理盐水组(P＜0.01)，几丁糖组、玻璃酸钠组优于生理盐水组(P＜0.01)，几丁糖组优于玻璃酸钠组(P＜0.01)。见表2。

表2 四组术后8周硬膜外瘢痕粘连大体观察 只

2.1.3 术后12周 术后12周聚乳酸防粘连凝胶组见瘢痕组织覆盖椎板缺损区，质地硬，大部分标本硬膜囊光滑，硬膜外瘢痕组织与硬膜无粘连。几丁糖组见瘢痕组织覆盖椎板缺损区，质地较硬，与硬膜粘连较致密，但仍可钝性分离。玻璃酸钠组见瘢痕组织覆盖椎板缺损区，质地较硬，瘢痕组织与硬膜粘连致密，不可钝性分离。四组评分比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，聚乳酸防粘连凝胶组优于几丁糖组、玻璃酸钠组及生理盐水组(P＜0.01)，几丁糖组、玻璃酸钠组优于生理盐水组(P＜0.01)，几丁糖组优于玻璃酸钠组(P＜0.01)。见表3。

表3 四组术后12周硬膜外瘢痕粘连大体观察 只

2.2 硬膜外瘢痕粘连组织学观察

2.2.1 术后4周 术后4周光镜下(下同)聚乳酸防粘连凝胶组见硬膜外胶原纤维增生较多，胶原纤维较疏松，排列规则;瘢痕粘连面积小，瘢痕组织与硬膜间见明显间隙，瘢痕粘连未向侧后方延伸，硬膜囊及脊髓未见受压。几丁糖组见硬膜外胶原纤维增生较多，胶原纤维疏松;瘢痕粘连面积小，瘢痕粘连有轻度侧后方延伸，硬膜囊及脊髓未见受压。玻璃酸钠组见硬膜外胶原纤维增生多，胶原纤维较致密;瘢痕粘连面积小，瘢痕粘连未见向侧后方延伸，硬膜囊及脊髓未见明显受压。三组评分与生理盐水组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);玻璃酸钠组、几丁糖组、及聚乳酸防粘连凝胶组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表4 四组术后4周硬膜外瘢痕粘连组织学观察 只

2.2.2 术后8周 术后8周聚乳酸防粘连凝胶组见硬膜外胶原组织少量增生，胶原纤维密度较低，排列规则;硬膜外瘢痕粘连面积小，瘢痕粘连未向侧后方延伸，硬膜囊未见受压同时存在明显腔隙。几丁糖组见硬膜外胶原组织中等量增生，胶原密度较高，排列较规则，瘢痕粘连面积较小，硬膜外腔有较明显间隙，部分标本局部硬膜囊轻度受压。玻璃酸钠组见硬膜外胶原组织大量增生，胶原密度高，排列杂乱，瘢痕粘连面积较大，硬膜外腔有部分间隙并有散在性粘连，局部硬膜囊中度受压。四组评分比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，聚乳酸防粘连凝胶组优于几丁糖组、玻璃酸钠组及生理盐水组(P＜0.01)，几丁糖组、玻璃酸钠组优于生理盐水组(P＜0.01)，几丁糖组优于玻璃酸钠组(P＜0.01)。见表5。

表5 四组术后8周硬膜外瘢痕粘连组织学观察 只

2.2.3 术后12周 术后12周聚乳酸防粘连凝酸组见硬膜外有少量胶原组织，胶原纤维密度低，排列规则;硬膜外瘢痕组织与硬脊膜几乎无粘连，瘢痕粘连亦未向侧后方延伸，硬膜囊未见受压并存在明显腔隙。几丁糖组见硬膜外有中等量胶原组织，胶原密度较高，排列较规则，部分标本硬膜外瘢痕组织与硬脊膜有粘连但面积较小，硬膜外腔间隙较聚乳酸防粘连凝胶组差，同时见部分标本局部硬膜囊轻度受压。玻璃酸钠组见硬膜外有大量胶原组织，胶原密度较高，排列不规则，小部分标本硬膜外瘢痕组织与硬脊膜有较明显间隙。四组评分比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，聚乳酸防粘连凝胶组优于几丁糖组、玻璃酸钠组及生理盐水组(P＜0.01)，几丁糖组、玻璃酸钠组优于生理盐水组(P＜0.01)，几丁糖组优于玻璃酸钠组(P＜0.01)。见表6，图1 ～4。

表6 四组术后12周硬膜外瘢痕粘连组织学观察 只

图1 几丁糖组(12周)

图2 聚乳酸防粘连凝胶组(12周)

图3 玻璃酸钠组(12周)

图4 生理盐水组(12周)

2.3 透射电镜观察 术后12周电镜下，生理盐水组纤维细胞中细胞器充分，合成胶原功能完全;玻璃酸钠组细胞器较少，胞质较少，线粒体较少，合成胶原功能较低，细胞核染色较深;几丁糖组细胞器较玻璃酸钠组少，胞质较多，合成胶原功能较低;聚乳酸防粘连凝胶组细胞器最少，胞质欠丰富，合成胶原功能最低，细胞呈现多角形形状同时胶原纤维成束，相对静止。

3 讨论

3.1 椎板切除后硬膜外瘢痕粘连形成机制 瘢痕组织是椎板切除后组织缺损区修复的必然产物。瘢痕修复分为三个阶段［3］:第一阶段为局部炎症反应阶段，在创伤后立即发生，持续约3～5天。主要表现为伤口出血停止，组织缺损区为血凝块所充填，继而引起各种趋化因子的释放，引起局部巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、肥大细胞、粒细胞及各种淋巴细胞的聚集。第二阶段为细胞增殖分化和肉芽组织形成阶段，持续约2～4周。成纤维细胞产生胶原纤维，血管内皮细胞和巨噬细胞大量增殖，创口局部血液和渗出液中的纤维蛋白原凝固成块，成纤维细胞及血管内皮细胞向血肿内侵入，毛细血管生长增殖而形成肉芽组织。第三阶段，组织重建阶段，成纤维细胞逐渐减少，转化为纤维细胞，毛细血管网消退，间质中的液体成分减少，肉芽组织转变为致密的瘢痕组织，此过程持续数周至几年。

3.2 椎板切除后硬膜外瘢痕粘连防治方法 硬膜外粘连的预防目前主要有三种［4～7］:①采用显微外科技术;②采用药物控制炎性反应;③采用隔离物阻隔。本实验采用隔离物避免瘢痕与硬膜接触来预防硬膜外瘢痕的形成。玻璃酸钠是广泛存在于人及动物各种组织的高分子物质，具有非常好的生物相容性，但因保持凝胶状态难以在特定的区域长期停留，从而影响其效果［8］。在本实验过程中涂布此药物于硬膜外后，因缝合肌肉组织及筋膜层时容易从切口溢出，因此影响其效果。同时因玻璃酸钠吸收速度较快故使其较早失去了物理屏障阻隔瘢痕长入的作用，故抗粘连效果欠佳。几丁糖是由甲壳类动物外壳中提取的天然高分子化合物，大量的基础研究证实其无毒、无刺激性、无抗原反应，具有可靠的生物相容性，是一种在体内可降解吸收的新型医用生物材料，并具有独特地选择性抑制成纤维细胞和抑制细菌生长从而达到预防粘连的目的。但在本实验过程中因其流动性较强，故不能稳定地停留在术后手术区域，并可随着体位地改变而发生向低处流动，故其预防硬膜外粘连并不十分理想。聚乳酸防粘连凝胶是以合成高分子材料聚乳酸为主要原料生产的，遇到水或组织液后迅速凝固成固态膜的新型医用防粘连材料，此膜具有以下特点:①微孔状结构保证了膜具有良好的柔软性;②与硬膜囊及神经根表面形状完全吻合，贴附性好，不随体位变化移动同时不被引流管引流出;③具有良好的透气性，不会妨碍硬膜外组织愈合;④成膜厚度在0.07～0.13mm之间，可避免药物经手术切口溢出。故聚乳酸防粘连凝胶预防硬膜外粘连的作用与以下几方面有关:①可作为一种良好的止血剂。聚乳酸防粘连凝胶遇到组织液即发生凝固，在硬膜囊及神经根表面形成一层固态膜封闭出血点故可减少术后血肿的形成进而从源头上减少瘢痕组织的形成［9］。在本实验造模时运用聚乳酸防粘连凝胶能够很好的封闭细微的出血点极大程度上减少了硬膜外瘢痕的形成。②具有良好的机械隔离作用:聚乳酸防粘连凝胶为一种半流体物质，当接触组织后即凝固成包绕硬脊膜及神经根的固态物质，从而达到三维立体预防粘连的要求，起到良好的机械隔离作用。本实验中，玻璃酸钠及几丁糖由于为凝胶状物质同时在其接触硬膜及组织液后其性状不发生改变，故隔离效果较聚乳酸防粘连凝胶差。③聚乳酸防粘连凝胶较长的降解时间可以渡过瘢痕增生活跃期。在本实验第8及12周取材过程中可观察到玻璃酸钠及几丁糖已大部分或完全吸收，而聚乳酸防粘连凝胶由于其膜性结构及较长的降解时间故可见完整的薄膜帖敷于硬膜上，同时在硬膜与瘢痕之间可见一明显腔隙，从而增强了其效果。④有抑制成纤维细胞生长的作用。通过电镜观察，本实验第12周取材后几丁糖组硬膜外组织中细胞器较少同时合成胶原功能较低，聚乳酸组中细胞器最少，合成胶原功能最低，并见细胞呈现多角形形状。故几丁糖、聚乳酸防粘连凝胶及玻璃酸钠都有预防硬膜外粘连形成的作用，但以聚乳酸防粘连凝胶为优。

［1］ Lawson KJ，Berry JL，Markey DL，etal.Lamina repair and replacement to control laminectomy membrane formation in dogs［J］.Spine，2002，17:213.

［2］ Nussbaum CE，Medonald JV，Baggs RB.Use of vicryl mesh to limit epidural scar formation after laminectomy［J］.Neurosurgery，2003，11:113.

［3］ 黎鳌.现代创伤学［M］.北京:人民卫生出版社，2002.142.

［4］ 凌沛学，管华诗.透明质酸钠粉雾剂预防术后硬膜粘连的研究［J］.中国药学杂志，2007，42(9):713-714.

［5］ 徐秋香，陈立科，刘文和.几丁糖预防椎板切除术后硬膜外瘢痕粘连及促进TGF形成的实验研究［J］.湘南学院学报(自然科学版)，2005，7(3):9-10.

［6］ 钟建明，王丹，杨文龙，等.游离脂肪片加透明质酸钠预防腰突症术后瘢痕粘连形成［J］.江西医药，2004，39(6):392-393.

［7］ Hinton JLJr，Warejcka DJ，Mei Y，et al.Inhibition of epidural scar formation after lumbar laminectomy in the rat［J］.Spine.2006:540-545.

［8］ GersztenPC，Moossy JJ，Flocking JC，et al.Inhibitionofepiduralsfibrosis after laminectomy using low-dose external beam radiation in dog model［J］.JNeurosurg，2004，46(6):1471-1481.

［9］ 刘立岷，宋跃明，段宏，等.聚乳酸薄板预防硬膜外瘢痕粘连的实验研究［J］.中国修复重建外科杂志，2005，19(1):48-51.