“三系”不育系微效恢复基因表现型研究

2010-12-05富昊伟李友发马兴华舒庆尧

作物研究 2010年1期

富昊伟,李友发,马兴华,舒庆尧

(1嘉兴市农业科学研究院 ,浙江嘉兴 314016;2浙江大学核农业科学研究所,杭州 310029)

中国完成杂交水稻不育系、保持系和恢复系的“三系”配套,迄今已逾 30年。“三系”不育系恢复性的遗传研究20世纪80年代中期已基本完成,主要是以单株或主穗的结实率为恢复基因表现型的考查指标,多数研究认为对野败胞质不育的主效恢复效应由 2对主基因控制[1～4],这对恢复系的育种实践起到了很好的指导作用。

“三系”不育系有一个普遍的现象:大量的保持系材料,最后转育成的“不育系”,常常因育性不稳定而不能成为有实用价值的不育系。即使生产上应用较广的不育系如Ⅱ -32A、龙特浦 A等,也出现了这种因育性不稳定而导致的自交结实现象[5]。对这种现象的研究相对很少。雷捷成等在分析该类型保持系转育不育系的测交 F1的花粉育性后,提出存在隐性的恢复基因,后来又进一步修正为微效恢复基因,即 r基因[6,7]。其后游年顺等进一步认为,微效恢复基因的表现型是转不育系杂交 F1的花粉黑染现象,并提出黑染率 0.1%～10%是含微效恢复基因品种的表现;同时还观察到转育不育系各世代的植株中经常出现“嵌合体”现象,即一朵颖花的 6个花药中,有1～2个可育花药,推测微效恢复基因受隐性多基因控制[8,9]。上述研究对微效恢复基因表现型及遗传特性认识提供了有用信息。

本研究旨在通过对一些典型保持系材料在转育“三系”不育系时各世代的育性观察,探讨微效恢复基因的 3种典型表现型特性,并探寻类似主效恢复基因遗传研究中结实率这样的量化指标,以为进一步研究微效恢复基因的遗传及分子标记等打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

4组“三系”不育系和保持系应用于本研究,分别为紫兴05A,紫兴05B;协青早 A,协青早B;黄玉 A,黄玉B;嘉浙 A,嘉浙 B。协青早A系商业应用20多年的不育系,应用过程中发现常有育性波动,认为含微效恢复基因。本研究应用的各世代种子系引进保持系后采用人工成对回交的方法获得。嘉浙A,紫兴05A,黄玉A系浙江大学或浙江嘉兴农科院选育,分别在 2000,2004,2005年通过浙江省技术鉴定[10～12]。在应用中发现嘉浙 A,黄玉A有不同程度的自交结实,暗示含微效恢复基因,而紫兴05A的不育性在生产上表现彻底败育,研究前推测它不含微效恢复基因。

2005年春季在海南陵水、2005年夏季在浙江嘉兴、2005年秋季在浙江嘉兴、2006年春季在海南分别配置了紫兴05A、协青早 A、黄玉 A、嘉浙 A与相应保持系的高世代转不育材料 BC8,BC9,BC10代种子(表 1)。需要说明的:一是协青早A系多年前引进,其转育确切世代已无从查考,但肯定在 BC20以上,在表 1中参照紫兴 05A等 3个材料的 BC8～BC10记录;二是后 3组材料中 BC2代种子的获得,在 BC1群体母本选株时均根据育种者的经验,尽可能选择和轮回亲本相似的单株和轮回亲本杂交。

表1 4组不育系和保持系材料及各世代种子的配置

各组材料上一世代的种子均大半保留在冰箱,仅部分用于下一世代种子的繁殖。例如:紫兴 05A/紫兴05B是 2005年春季在海南收获 20 g左右 F1代种子,其中 15 g贮存在 4℃冰箱,其余 5 g左右用于对 BC1代种子的繁殖。下一世代种子的获得均同此法。

1.2 方法

2007年夏季,表 1中的所有材料均种植在浙江省嘉兴市农科院试验区。每份材料均在30株以上,4月15日播种,5月12日移栽。田间管理注意肥水平衡,不缺肥不徒长,始穗期田间有浅水。

考查了不育系育性表现的 3种表现型,分别为自交套袋结实率、嵌合颖花率、黑染花粉率。具体的考查取样及方法如下。

1.2.1 自交套袋

每份材料各种植30株。由于黄玉A、B的生育期较长,为了使其与其它各组材料基本在同一时段抽穗,黄玉 A/黄玉B及紫兴05A/紫兴05B二组材料4月 5日播种。其余5组材料4月30日播种。适时移栽,田间采用该季水稻常规肥水管理方法。抽穗阶段逐日观察植株的抽穗开花情况,每株植株的主穗抽出而尚未开花时(一般抽出 3～5 cm),用 7 cm×35cm的牛皮纸袋将穗套袋以隔断外来花粉。在主穗套袋后 7 d,每株再套袋一个刚抽出未开花的迟分蘖穗(落脚穗)。均在套袋后20 d考查套袋自交结实率。

1.2.2 嵌合颖花率

上述材料每株植株均在抽穗阶段选择次于主穗的第二分蘖穗及7 d后的1个小分蘖穗。将该穗的每一朵颖花的6颗花药均剥出来观察花药的颜色分离情况。6颗颖花全部为典型不育系瘦小乳白色花药的为不育颖花;有1～6粒(含1粒)黄色饱满花药的,该朵颖花记为嵌合颖花。嵌合颖花占全部颖花的百分比,记为嵌合颖花率。

1.2.3 花粉育性

(1)随机取样的花粉育性。在上述观察嵌合颖花率的取样穗中,随机在穗的上、中、下部各取 2朵颖花,每朵颖花随机取 2～3个花药混合后置于玻片上,加0.1%的 I2-IK溶液,用镊子夹碎挤出花药中的花粉。置于4×10倍的显微镜下观察3个有代表性的视野,统计黑染花粉(即染败和正常花粉之和,下同)的比例。

(2)选择性取样花药的花粉育性。分别取在上述观察中的两类花粉观察:一类为瘦小乳白色花药,另一类为饱满黄色的花药。各挑取这样的花药5个,混合置玻片上,加0.1%的I2-IK染色后,40倍显微镜下观察3个有代表性的视野,统计黑染花粉的比例。

2 结果与分析

2.1 不育系表现不同程度的可育性

4个高代不育系紫兴 05A、协青早 A、黄玉 A、嘉浙A在3个世代的套袋自交结实率、嵌合颖花率、黑染花粉率的考查结果见表2。

(1)紫兴 05A/紫兴 05B。 BC8,BC9,BC10套袋自交结实率、嵌合颖花率主穗、迟分蘖穗均为0。该材料因没有嵌合花药,花粉育性检测均是随机取样,主穗的黑染花粉率均为0;仅在迟分蘖穗的镜检花粉中发现极少量染败花粉,各世代的黑染花粉率分别为 0.021%,0.014%和 0.018%,这和笔者选用该材料前历次观察试验(数据未给出)一致。

(2)协青早 A/协青早 B。 BC8,BC9,BC10主穗的套袋自交率介于 0.86%～1.12%,迟分蘖穗的套袋自交结实率介于 2.16%～2.97%;嵌合颖花率主穗介于10.30%～11.32%,迟分蘖穗介于16.88%～17.32%;随机取样的主穗黑染花粉率在 0.27%～0.36%,迟分蘖穗在 0.17%～0.21%;分类取样中专门选择嵌合颖花中饱满黄花药检测的主穗黑染花粉率为 4.85%～5.21%,迟分蘖穗为6.09%～6.48%。

(3)黄玉 A/黄玉B。3个世代的主穗和迟分蘖穗的套袋自交结实率分别介于1.59%～2.00%和2.16%～2.97%;嵌合颖花率分别介于 22.59%～23.40%和30.09%～30.34%;随机取样的黑染花粉率则分别介于0.22%～0.37%和0.59%～0.83%。

(4)嘉浙 A/嘉浙 B。各世代的主穗和迟分蘖穗的套袋自交结实率分别介于1.47%～1.54%和2.89%～3.19%;嵌合颖花率分别介于 38.69%～40.83%和53.62%～57.35%;随机取样的黑染花粉率分别介于1.09%～1.42%和 2.61%～3.58%;饱满黄花药检测的黑染花粉率分别为 15.98%～16.28%和 19.23%～21.44%。

表2 微效恢复基因各表现型在4个高代不育系中的表现

对上述 4组数据进行分析,有如下发现:(1)紫兴05B各转育世代检测的各项指标均为 0或趋向 0,因此认为紫兴05B不含微效恢复基因。而协青早B、黄玉B、嘉浙 B均有不同程度的套袋自交结实率、嵌合颖花率和黑染花粉率,且同一材料的这 3项指标世代间表现稳定,没有显著差异,由此推断它们是含有微效恢复基因的保持系。(2)协青早 A、黄玉 A、嘉浙 A在套袋自交结实率和随机取样的花粉黑染率上无明显差异,暗示套袋自交结实率和随机取样的黑染花粉率不能有效区分这3个材料微效恢复基因表达的不同。但在分类黄花药取样的黑染花粉率和嵌合颖花率两个指标上,三者之间存在显著差异,可以有效区分三者的不同。(3)无论主穗或是迟分蘖穗,3项表现型指标在3个材料中表现的共同特点是,嵌合颖花率>分类取样中饱满黄花药的黑染花粉率>套袋自交率>随机取样的黑染花粉率。(4)嵌合颖花率的数值和套袋自交率或随机取样的黑染花粉率相比,存在10倍以上的数量级差异。以3个转不育世代主穗平均值作比较,协青早 B的套袋自交结实率、黑染花粉率和嵌合颖花率分别为 1.01%,10.90%,0.33%;黄玉 B的分别为 1.77%,23.10%,0.31%;嘉浙 B的分别为1.50%,39.88%,1.23%。

2.2 不同表现型的可量化特点

套袋自交结实率是考查最方便的,也是主效恢复基因研究中应用最多的育性考查指标,很自然地会推测其能否作为微效恢复基因的可量化指标。从表2可以看出,套袋自交结实率作为不育系育性的表现型,有两个特点:一是结实率的绝对值很小,在 10-2数量级,其二是标准差较大。以BC8代为例,协青早 A,黄玉 A,嘉浙 A的主穗套袋自交结实率分别为 0.86±0.55%,2.00± 0.73%,1.47± 1.31%,迟分蘖穗分别为 2.89±1.32%,2.97± 1.68%,3.13± 1.62% 。 BC9,BC10世代的数据也有相同趋势。此外,考种实践也证实,该数量级的自交结实率,绝大部分套袋稻穗的结实谷粒在0～3粒之间,其表达的结实率变化的范围相当狭窄。此外,即使在嵌合颖花率达到40.83%的嘉浙A的BC8的30个套袋自交穗中,仍有 3个穗的自交结实率为 0,占观察数据的10%。协青早A的BC8套袋自交结实率为0的有7个,占23.3%(数据未列出)。由此可以认为,群体的平均套袋自交结实率虽然一定程度上定性反映了微效恢复基因的表现,但在需要考查单个植株的表现型(这在遗传研究分离群体时是必需的),套袋自交结实率会出现根本性的偏差,因此不能作为微效恢复基因遗传研究的可量化指标。

随机取样的黑染花粉率,与套袋自交结实率的数据具有相似之处,即绝对数值较小,而标准差较大。同样以协青早 A、黄玉 A、嘉浙 A的 BC8代主穗的随机取样黑染花粉率为例,3组观察值分别为0.36±0.77%,0.33±0.60%,1.17±1.00%。其它各世代也有类似的趋势,因此也不宜作为微效恢复基因遗传研究的可量化指标。

但是,分类取样中专取饱满黄花药观察的黑染花粉率表现不同,协青早 A,黄玉 A,嘉浙 A的BC8代主穗的分类取样黑染花粉率分别为5.01±1.05%,10.56±1.46%,16.19±2.09%,数据的绝对值较随机取样的黑染花粉率有数量级的增加,标准差也相对减小,其迟分蘖穗的观察数据也是相同的趋势,分别为 6.13±1.29%,12.15± 1.42%,9.96± 2.28%(表 2)。可见 ,专取黄花药观察的黑染花粉率已初步具备作为可量化指标的特点。其缺陷可能在于实际操作中如果大样本观察,以水稻的单穗为100粒计,对一个穗所有颖花中的饱满黄花药进行花粉镜检,工作量就比较大,更不用说一个群体中的所有穗的颖花镜检的工作量了。

嵌合颖花现象是可比较简便地观察的表现型。只需剥开颖壳,则不育系中黄花药(通常较肥大)和水渍状的乳白花药是能直观区分的。其次,在4个不同材料之间,嵌合颖花率有明显层次差异。以BC8～BC103个世代的平均值为例,紫兴05A主穗和迟分蘖穗均为0;协青早 A分别为 10.90%和 17.09%;黄玉 A分别为23.10%和30.23%;嘉浙 A分别为 39.88%和55.01%(表 2)。彼此之间差异均达显著水平,说明嵌合颖花率能有效区分不同类型材料微效恢复基因的表现。再次,嵌合颖花率的数据绝对值也是 3个指标中最大的,且标准差较小,具有稳定性。更重要的是,由于一朵颖花有6个花药,而嵌合颖花定义为只要有1个以上花药为饱满黄花药即为嵌合颖花,实际操作中可以避免如花粉镜检时取样的误差,实现全样本检测,避免取样误差。还有一点,从对嵌合颖花中饱满黄花药和瘦小乳白花药的分类花粉育性观察中发现,瘦小乳白花药中不含黑染花粉,黑染花粉完全来自饱满黄花药(表2)。这就进一步说明嵌合颖花中的黄花药确是微效恢复基因的表现型载体。

综上所述,我们认为嵌合颖花率具备了作为微效恢复基因研究中可量化指标的条件,是最合适的可量化指标。

3 讨论

从生物学角度看,套袋自交结实率的影响因素包含了花粉发育、开花、受精及其环境影响的生理、生态等诸多因素,并不是恢复性的真实反映。而花粉育性反映的是花粉不育性的遗传特性,应是研究恢复性的关键数据。本研究证实可作微效恢复基因表现型量化指标的嵌合颖花,在某种程度是介于上述两个指标之间的一个指标。它是黑染花粉的载体,是微效恢复基因花粉育性的体现,但又可以颖花为单位进行考查,具有操作上的简便性。虽然嵌合颖花这种表现型并不是本研究首次提出,如游年顺等提出的“嵌合花粉囊”[9],与“嵌合颖花”是同一个概念,但他们未曾就该指标是否可用于量化进行分析,更未曾应用该指标对微效恢复基因的遗传规律进行研究,因此该量化指标的重新提出,对微效恢复基因的遗传研究是一个有力的推进。

本研究还发现嵌合颖花率在主穗和迟分蘖穗之间有一定差异,一般表现为迟分蘖穗的嵌合颖花率较主穗为高,这可能和主穗和迟分蘖穗花粉发育时期不同的环境有关。

此外,我们应用嵌合颖花率这个指标对嘉浙 B的微效恢复基因的遗传进行的研究已初步完成,结果将后续报道。

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