HPLC法测定大黄相关制剂中大黄素的含量

荆 晶，陆小丹，周旭美

（遵义医学院 药学院，贵州 遵义563003）

大黄为蓼科植物掌叶大黄（Rhrum palmatum L.）、唐古特大黄（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或药用大黄（Rheum officinale Baill.）的干燥根及根茎[1]。具有泻下攻积、清热泻火、止血、解毒、活血化瘀之功效。大黄中的主要药效成分为蒽醌类衍生物如大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄酸等[2]。清胰Ⅱ号是由大黄、栀子、赤芍、丹皮等中药研制的复方制剂。具有清热凉血、理气开郁、活血止痛、通理攻下的作用，用于治疗急性胰腺炎已有三十多年的临床经验[3]。经近上千多例急性胰腺炎，近上百例重症急性胰腺炎（SPA）的治疗、总结，收到较好的疗效，SPA的治愈率显著上升，达到国内领先水平。

1 材料与方法

1.1 药品试剂 大黄素对照品（含量测定用，批号∶110756－200110中国药品生物制品检定所），乙腈（色谱纯，上海星可生化有限公司），乙醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），冰醋酸（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），甲醇（色谱纯，上海星可生化有限公司），高纯水。

1.2 仪器 美国Agilent 1100高效液相色谱仪，包括紫外检测器和色谱工作站。Agilent Eclipse XDB C-18（150×4.6mm，0.46μm） 色谱柱。塞多利斯BT125D电子天平（北京塞多利斯科学仪器有限公司）。

1.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB C-18（150×4.6mm，0.46μm）。以乙腈-0.1%冰醋酸溶液（50∶50）为流动相；检测波长为254nm，流速1.0ml/min，柱温为30℃，进样量20μl[4]。

1.4 溶液制备

1.4.1 对照品溶液的制备 称取大黄素标准品0.6mg，置于25ml的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至25ml，配成 0.024mg／ml的大黄素标准液，置于 4℃冰箱中保存。

1.4.2 清胰Ⅱ号供试品溶液的制备 按照清胰Ⅱ号的配方称取原料[5]，将原料放在煎煮锅里进行煎煮（大黄、芒硝除外）。煮前快速浸泡5min左右，放干水，次日加入适量的水煎煮20min后，将已浸洗的大黄放入锅中，再酌加适量的水继续煎煮10min，药液放出过滤，药渣加入适量的水继续煎煮，每次30分钟。药液过滤合并。将药液进行浓缩，用部分药液将芒硝溶解，合并药液，加入适量的苯甲酸钠至药液中，使至规定体积500 ml，使最后药液中苯甲酸钠的浓度为1.5%，搅拌均匀，备用。

1.4.3 清胰Ⅱ号对照品溶液的制备 不加入大黄，按照清胰Ⅱ号供试品溶液的制备方法操作，其他步骤均相同，制得大黄的阴性对照品溶液，备用。

2 含量测定

2.1 测定波长的选择 根据2005年版《中国药典》第一部附录ⅤA的紫外可见分光光度法，扫描大黄素的最大吸收波长，扫描范围200～600nm，大黄素的最大吸收波长为254nm，与大黄药材含量测定项下的测定波长相一致，确定大黄素的测定波长为254nm。结果见图1。

图1 大黄素光谱扫描曲线Fig 1 UVscanning of Emodin

2.2 系统适应性实验 以乙腈-0.1%冰醋酸溶液（50∶50）为流动相；检测波长为 254nm，流速 1.0ml/min，柱温为30℃，进样量20μl此条件下对照品、供试品在约12min时间均有一色谱峰，阴性对照品无干扰。见色谱图2。

图2 大黄素高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatogram s of Emodin

2.3 线性关系的考察 采用大黄素标准品溶液制得一系列梯度溶液，其浓度分别为1.2μg/ml、2.4μg/ml、4.8μg/ml、7.2μg/ml、9.6μg/ml、12.0μg/m l。按

2.2 色谱条件进样20μl，测定大黄素对照品的峰面积，将浓度与峰面积进行线性回归处理，得出回归方程为：Y=72.638X+31.042，r=0.9999，大黄素对照品在1.2μg/m l～12.0μg/ml范围内样品浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验 精密吸取大黄素对照品溶液（浓度为4.8μg/ml）20μl，按上述色谱条件，重复进样6次，每次20μl，测定对照品中大黄素峰面积值，计算峰面积值的RSD为1.12%。说明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 精密吸取大黄素供试品溶液20μl，按上述色谱条件，每隔两小时，测定供试品溶液中大黄素峰面积值，计算供试品大黄素峰面积值的RSD为1.72%。说明供试品在10h内稳定。

2.6 重复性试验 取清胰Ⅱ号水提法提取液，称取10.00g，共6份，置于25ml容量瓶中，用甲醇定容并超声30min[6]，按上述色谱条件进行测定，测定结果经数据处理，平均含量14.137μg/g，RSD为0.29%。

2.7 加样回收率试验 取本品(批号）共9份，每份重约5.00g，置于25ml容量瓶中，分别精密加入大黄素对照品溶液（7.2μg/ml）8ml、10ml、12ml。余下的量用甲醇补足，然后超声30min，冷却后，吸取20μl，测定峰面积计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收率实验结果

2.8 大黄素含量测定 按照前文所述的方法和条件测试六批样品，并计算其含量。结果如表2。

表2 大黄素含量测定

3 讨论

本次实验采用高效液相色谱法对大黄素相关制剂清胰Ⅱ号汤剂中大黄素进行含量测定，与其他方法相比，具有操作简便，准确性好，灵敏度高，重现性好的特点，在制订大黄相关重要制剂的质量标准时，可以使用大黄素含量作为指标。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典Ⅰ部［S］.化学工业出版社，2005.17.

[2]徐雄良,张志荣.超声提取法测定熊胆消炎胶囊中大黄素和大黄酚的含量[J].华西药学杂志,2003,18(6):442-444.

[3]赖良，王洋.清胰汤在重急性胰腺炎治疗中的作用［J］.中国基层医药，2006，13（1）：95-96.

[4]Jun Cai，MD.Feassibility Evaluation of Emodin（Rhubarb Extract）as an Inhibitor of Pancreatic Cancer Cell Pancreatic In Vitro［J］.Original Communications,2008,32(2):190-196.

[5]杨骁军.高效液相色谱法测定安神益脑丸中大黄素的含量［J］.海峡药学，2009，21（7）：71-73.

[6]周卿.RP-HPLC同时测定清胰汤颗粒中栀子苷芍药苷个含量［J］.重庆医科大学学报，2007，32（6）：269-270.