肾糖颗粒对糖尿病肾病大鼠24 h尿蛋白、血糖及肾组织PDGF-B表达的影响*

赵延栋,傅晓骏

(1.浙江中医药大学,浙江 杭州310053;2.金华市中医院肾内科,浙江 金华321017)

糖尿病肾病(diabetic nephrahy, DN)是糖尿病特有的严重微血管并发症,由于该病起病隐匿,早期常无明显临床表现, 因此,如能早期诊断、早期治疗,对阻止和延缓DN的发展有着重要意义。 DN发病机制十分复杂,到目前为止尚不能完全阐明。目前国内外医学认为DN的发生及发展是多因素综合作用的结果[1]。近年研究表明,血小板衍化生长因子B(PDGF-B)参与了DN的发生和发展[2]。本试验通过观察肾糖颗粒对糖尿病大鼠血糖、24 h尿蛋白及肾组织PDGF-B表达的影响,探讨其对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康雄性 SD大鼠 70 只, 清洁级, 体质量(160±20)g,由上海中医药大学动物实验中心代购并饲养,动物质量合格证号:NO.0066490。

1.2 药物、试剂与仪器

肾糖颗粒由黄芪、水蛭等药物组成,常规水煎,醇提,浓缩成颗粒剂,由浙江金华市中医院中药制剂室提供。用时以蒸馏水溶解,使生药含量分别为黄芪2 g/mL、水蛭粉0.33 g/mL。盐酸贝那普利片(商品名称为洛汀新),剂量为10 mg/片,北京诺华制药有限公司产品,用时将1片盐酸贝那普利片溶于30 mL蒸馏水中。链脲佐菌素(STZ),美国Sigma公司产品,批号S0130;尿蛋白定量试剂盒,购自南京建成生物工程研究所,批号C035;兔抗鼠PDGF-B多克隆抗体,购自武汉博士德生物工程有限公司,批号BA0519;SP免疫组化二抗试剂盒(通用型),购自麦约尔生物技术有限公司,批号CatalogNO-HSP0007。LEICA荧光倒置显微镜及LEICADFC295图像采集系统,均为LEICA Microsystems Ltd.产品,均由上海中医药大学肾病研究所提供。

1.3 分组与给药

将大鼠适应性喂养1 周后,随机取8只为正常对照组,给予普通饲料喂养;剩余大鼠给以高脂饲料喂养,并腹腔注射STZ建立糖尿病肾病模型。实验期间大鼠自由进食、饮水,不使用胰岛素及其他降糖药物。大鼠禁食12 h后(晚7 点到第2 天早上7点),每只大鼠先腹腔内注射0.5 mL福氏完全佐剂(CFA), 第2 天再按 25 μg/g体质量腹腔内注射STZ,每周1次,连续3周重复上述步骤。每周造模第6天测试血糖。正常组腹腔注射等量枸橼酸缓冲液作对照。血糖16.7 mmol/L为糖尿病(DM)造模成功。将DM大鼠在最后一次注射STZ两周后投入代谢笼收集尿液, 测定点时尿蛋白/肌酐比率(ACR),造模组和正常对照组对比差别无统计学意义者予以剔除。将合格的32只大鼠根据ACR随机分为模型对照组、盐酸贝那普利片组、肾糖颗粒组、肾糖加盐酸贝那普利片组4组,每组8只。肾糖颗粒组给予肾糖颗粒灌胃,其中黄芪 0.02 g/g体质量、水蛭粉3.3 mg/g体质量,相当于成人剂量的20倍;盐酸贝那普利片组给予盐酸贝那普利片灌胃,3.3 mg/g体质量,相当于成人剂量的20倍;肾糖加盐酸贝那普利片组给予此两种药物灌胃。正常对照组和模型对照组灌胃等量的蒸馏水, 1次/d,共8周。

1.4 检测指标

灌胃第8周最后1 d代谢笼收集24 h尿, 采用化学比色法测定24 h尿蛋白。禁食8 h后,称重、麻醉,无菌条件下腹主动脉取血分离提取血清,采用OneTouchUltra血糖仪测血糖(GLU);剖取肾脏,去除包膜后沿矢状线正中切开,取1/2 肾脏用10%甲醛溶液固定,取小块皮质,采用免疫组织化学方法检测肾组织PDGF-B表达。其操作步骤如下:①迅速取出小块肾皮质,乙醇逐级脱水,石蜡包埋,制成4 μm厚的石蜡切片。②切片脱蜡置水, 3% H2O2室温孵育 5～10 min以消除内源性过氧化物酶的活性;蒸馏水冲洗, 磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5 min;置入抗原修复液,微波炉修复,冷却。③5%～10%正常山羊血清封闭, 室温孵育10 min。 ④倾去血清,勿洗;滴加兔抗鼠PDGF-B多克隆抗体 , 4℃过夜;第2天取出,用PBS洗, 5 min×3 次。⑤滴加通用型生物素化二抗, 37 ℃孵育10～30 min;PBS洗,5 min×3次。⑥滴加HRP标记链亲和素, 室温孵育10～ 30 min;PBS洗, 5 min×3 次。⑦PBS洗后,DAB显色;自来水充分冲洗;苏木素复染, 封片。每张切片在LEICA显微镜400倍下 用LEICADFC 295图像采集系统随机选取10 个含肾小球的视野,用Image-ProPlus图像分析软件测量免疫组化染色的积分光密度值(inter grated optical density, IOD)。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 肾糖颗粒对DN大鼠24 h尿蛋白、血糖的影响

模型对照组血糖、24 h尿蛋白升高,与正常对照组对比,差别有统计学意义(P＜0.01);各治疗组的以上两指标降低,与模型对照组对比,差别有统计学意义(P＜0.01);肾糖颗粒组以上两指标均低于盐酸贝那普利片组, 但差别无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠的24 h尿蛋白、血糖对比 ±s

表1 各组大鼠的24 h尿蛋白、血糖对比 ±s

注:与正常对照组对比, ** P＜0.01;与模型对照组对比, ##P＜0.01。

组 别 动物数 血糖/mmol·L-1 24 h尿蛋白/mg·24 h-1正常对照组 8 7.25 ±0.95 13.01±3.72模型对照组 8 32.38 ±1.26** 91.77±14.33**肾糖颗粒组 8 24.59 ±1.98## 53.41±24.35##盐酸贝那普利片组 8 26.10 ±3.51## 54.10±22.14##肾糖加盐酸贝那普利片组 8 23.33 ±5.62## 38.34±14.18##

2.2 肾糖颗粒对DN大鼠肾组织PDGF-B表达的影响

正常对照组大鼠肾组织中PDGF-B免疫组化染色,仅可见极少量的棕色颗粒, 且着色非常浅淡(见图1)。模型对照组大鼠肾组织可见明显的棕褐色颗粒存在(见图2)。3个药物组强度介于正常对照组和模型对照组之间(P＜0.05)(分别见图3～5),而肾糖加盐酸贝那普利片组分别低于肾糖颗粒组和盐酸贝那普利片组,肾糖颗粒组也低于盐酸贝那普利片组,但差别均无统计学意义(P＞0.05)(见图6)。

3 讨 论

DN是糖尿病重要的慢性并发症之一, 也是糖尿病患者死亡原因之一,临床治疗的手段和效果相当有限, 因此积极寻找有效的药物治疗糖尿病肾病具有重要的意义。高血糖可引起蛋白尿,而蛋白尿是糖尿病肾病的重要临床表现,长期的蛋白尿能引起肾小管上皮细胞损伤并诱使炎性因子和细胞外基质的产生,从而直接引起进行性肾损伤的病理变化。因此蛋白尿的出现不仅是肾脏损坏的一种标志,更是促进肾病进展的重要因素;治疗和预防糖尿病肾病不仅仅需要控制血糖,有效地控制蛋白尿也尤为重要。本实验结果表明,肾糖颗粒可以明显降低糖尿病肾病大鼠血糖且能较好地减少尿蛋白的排泄。通过降低血糖,可使毛细血管数得以恢复,基底膜增厚得以抑制,从而可改善肾血管内皮细胞的损伤。通过对氧自由基的清除,可使肾小球基底膜损害降低,减少了尿蛋白的丢失,从而阻止了DN的发生和发展。

中医学依据DN临床表现将其归属于“肾消”、“水肿”、“关格”等范畴。其基本病机为气虚血瘀,贯穿于疾病的全病程。基于此,笔者以益气、活血、化瘀为法组成肾糖颗粒方。方中黄芪性温,有益气、补虚、消肿的功效,走而不守,可益气扶正;水蛭为传统的破血、逐瘀、通经药,行血、散瘀、通络、抗凝,且作用平和、不伤阴血。现代医学也证实,黄芪益气健脾,可抗血小板凝集,降低血黏度、改善微循环,降低蛋白尿,从而改善DN患者的高灌注、高滤过状态;水蛭中的水蛭素抗凝作用是肝素的20倍,且与凝血酶原亲和力极强,具有减轻氧自由基损伤、抗脂质过氧化、改善血脂代谢及增强纤溶活性、抗凝抗血栓作用[3]。两者合用,可针对糖尿病肾病的病理基础进行治疗,减少尿蛋白的排出,改善肾功能。近年有实验证明, 糖尿病肾病的病理改变、临床表现与细胞因子密切相关。研究中发现血小板衍化生长因子(PDGF)可诱发血管收缩和舒张,刺激系膜细胞收缩,并通过影响TGF-β、前列腺素而引起系膜细胞外基质(ECM)产生和系膜细胞有丝分裂效应,使ECM成分如胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘蛋白等的合成作用增强,导致ECM聚积、肾小球硬化[4]。本实验显示,正常大鼠肾组织中有极少的PDGF-B的表达,而模型对照组糖尿病大鼠肾组织中PDGF-B的含量明显增高。这种结果的可能机制是:DN早期肾组织改变主要以肾脏系膜细胞增生为主(后者是分泌PDGF-B的主要细胞)。另外,高血糖通过激活PKC信号传导途径促进了PDGF-B的表达,并能显著提高PDGF-B在单核-巨噬细胞、肾脏系膜细胞和血管内皮细胞的表达。而笔者的实验显示,肾糖颗粒组大鼠肾组织中的PDGF-B的含量明显比模型对照组低(P＜0.05),表明肾糖颗粒可以抑制PDGF-B在糖尿病肾病大鼠肾组织中过度表达。

综上所述,肾糖颗粒可通过降低糖尿病肾病大鼠的血糖、24 h尿蛋白来有效改善肾功能,并能明显下调细胞因子PDGF-B的表达。因此,推测通过抑制PDGF-B在糖尿病肾病大鼠肾组织中过度表达来减轻肾小球硬化和ECM的沉积是肾糖颗粒保护糖尿病肾病大鼠肾功能的机制之一。

[1]张振忠,豆小妮, 赵宏波.糖尿病肾病发病机理的研究进展[J].现代中医药, 2008, 28(2):55-57.

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[3]强胜.冯春俭.黄敏.益气解毒化瘀法治疗糖尿病肾病的临床观察[J].中国医药导报, 2009, 6(2):66-67.

[4] KlahrS, Morrissey JJ.The role of vasoactive compounds,Growth factors and cytokines in the progression of renal disease[J].Kideney Int, 2000, 75(Supple):7-14.