原发性痛经寒凝血瘀证药效评价模型的建立

卢阿娜，蔡妍阳，宋 梦，张文通，赵 欣，徐雪雁，蔡大勇

原发性痛经无特异性药物治疗的主要原因是缺乏药效评价模型［1］。中医临床对原发性痛经进行辨证施治，其中，对最常见的寒凝血瘀证，重视寒性症状群和疼痛症状群［2］。寒性症状群的临床病理生理机制为适应性产热低下［3］，异丙肾上腺素所诱导的产热潜能可定量观察该产热低下［4］。疼痛症状群的临床病理生理机制为局部宫腔痉挛性收缩［5］，催产素所诱导的宫腔内压可定量观察该局部挛缩［6］。因此，序贯实施肩胛骨间棕色脂肪切除、抑制甲状腺功能和促进子宫内膜增生建立原发性痛经寒凝血瘀证的大鼠模型;以模型大鼠为研究对象，分析静脉给予异丙肾上腺素诱导产热和催产素诱导宫腔内压的量效关系。结果所计算获得的ED50可作为原发性痛经寒凝血瘀证药效评价的合适刺激剂量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 ♀ SD大鼠36只，6周龄，体质量(190.1±12.5)g购自北京维通利华实验动物技术有限公司;标准饲料购自北京科澳饲料有限公司。每日光照黑暗各12 h，温度25℃，湿度45%，自由饮食。

1.1.2 试剂 上海禾丰制药有限公司的盐酸异丙肾上腺素注射液(1 mg/2 ml，生产批号080401)和催产素注射液(10 U·ml－1，生产批号081102)，广东华南药业集团有限公司丙硫氧嘧啶片(50 mg/片，生产批号090301)，北京益民药业有限公司己烯雌酚片(1 mg/片)。

1.1.3 设备 高压灭菌锅;烤箱;空调;温度计;自制拉钩器材;BL-420E+生物机能实验系统;温度传感器与压力传感器各4只;自制子宫颈扩张器系列、压力传导导管及其末端橡胶球囊。

1.2 动物分组处理

1.2.1 模型建立 36只大鼠均进行下述造模处理。

1.2.1.1 棕色脂肪切除 动物适应喂养3 d后，均进行肩胛骨间棕色脂肪切除。腹腔注射10%水合氯醛0.003 ml·g－1麻醉，俯卧位固定，备毛，消毒，铺孔巾。无菌操作，两肩胛骨上下缘连线中点作为背正中线切口的起止点(约2.0 cm)，沿皮下组织分离皮肤，拉钩暴露肩胛骨间蝶形棕色脂肪，沿边缘外2 mm，肌层以上，完整切除蝶形棕色脂肪;带着皮下筋膜缝合手术切口。碘伏棉球包扎，手术前后各3 d肌肉注射青霉素0.02万U·g－1预防感染。

1.2.1.2 甲状腺机能抑制 术后d 7开始，灌胃给予含丙硫氧嘧啶(30 μg·g－1)的 0.5%CMC 混悬液 5 μl·g－1，连续42 d。

1.2.1.3 子宫内膜增生 术后d 21开始，灌胃给予含雌激素(1 μg·g－1)的质量分数为0.5%CMC 混悬液5 μl·g－1，连续28 d。

1.2.1.4 宫颈预扩张 术后d 40开始，采用系列宫颈扩张器(直径依次为 1，2，3，4，5，6 mm)逐日增大扩张器直径，在自制拉钩引导下，以眼科镜光源直视宫颈口，扩张宫颈，每天2次(8 am和8 pm)，直径6 mm，巩固2 d。温度传感器探头直径为2.5 mm，自制压力插管前端球囊零压力下直径为4 mm，均小于最大扩张器直径6 mm。

1.2.2 分组处理 所造模的36只大鼠(190.1±12.5 g)，禁食12 h后称质量。体质量均衡，随机分9组，每组4只。术后d 47进行9个等比剂量组的异丙肾上腺素刺激产热观察;术后d 49进行9个等比剂量组的催产素诱导宫腔内压观察。

1.2.3 指标观察 检测环境温度28℃，湿度45%，减低噪音、光照、震动和空气对流(风速)。生物机能实验系统接零线屏蔽干扰，预先调零及定标。

1.2.3.1 异丙肾上腺素诱导产热 乙醚浅时程麻醉后仰卧固定，子宫腔内距宫颈20～24 mm放置温度传感器探头;用注射器连接头皮针，吸取所计算稀释的盐酸异丙肾上腺素浓度，排净气泡，用头皮针进行尾静脉穿刺并固定;连续监测清醒大鼠宫腔内局部温度变化，当温度曲线稳定30 min后，尾静脉注射给予相应剂量的异丙肾上腺素，记录120 min温度。以给药前后单位时间曲线下面积的变化率计算诱导产热的ED50。根据预实验得出异丙肾上腺素刺激正常大鼠产热剂量有效范围［7］，以 0.1 μg·g－1为中心，k=0.8，设计 9个剂量组，即 0.064、0.08、0.1、0.125、0.156、0.195、0.244、0.305、0.382 μg·g－1。

1.2.3.2 催产素诱导子宫腔内高压 水合氯醛麻醉后仰卧固定，子宫腔内距宫颈20～24 mm放置压力传感导管的末端橡胶球囊(4 mm未充盈直径);连接压力传感器通道，并排净传感通道的所有气泡，微量螺旋注射器通过三通管施加前负荷，按预实验得大鼠子宫腔内压力最适前负荷［8］，用注射器连接头皮针，吸取所计算稀释的催产素浓度，排净气泡，用头皮针进行尾静脉穿刺并固定;连续监测大鼠宫腔内局部压力变化，当压力曲线稳定30 min后，撤销前负荷，使子宫无压力自由收缩舒张5 min后，再给予相同前负荷，尾静脉注射给予相应剂量的催产素，记录30 min压力。以给药前后曲线下面积的变化率计算诱导宫缩的ED50。根据小鼠预实验所得催产素ED500.04 U·g－1的大鼠等效剂量0.02 U·g－1为中心，k=0.75，设计 9 个实验组，即 0.006、0.008、0.011、0.015、0.020、0.027、0.036、0.047、0.063 U·g－1。

1.3 数据分析 以产热温度曲线下面积，计算异丙肾上腺素给药所致面积变化率［δST=(STa-STb)/STb］;以宫腔内压力曲线下面积，计算催产素给药所致面积变化率［δSP=(SPa-SPb)/SPb］;以±s表示各剂量组变化率数据，以给药对数剂量对面积变化率，用Prism-4统计软件计算异丙肾上腺素或催产素用量的ED50及其95%置信区间。

2 结果

2.1 异丙肾上腺素诱导原发性痛经寒凝血瘀证大鼠适应性产热的量效关系 数据(Tab 1)结果表明，异丙肾上腺素诱导痛经寒凝血瘀证模型大鼠产热的ED50为0.210 μg·g－1，95%置信区间为0.167～0.264 μg·g－1，用量与单位时间曲线下面积变化率相关方程为 ^Y=0.01503+0.03611/(1+106.839(0.03891－x))，r=0.969。

2.2 催产素诱导原发性痛经寒凝血瘀证大鼠子宫腔内压的量效关系 数据(Tab 2)结果表明，催产素诱发寒凝血瘀证大鼠宫腔压力的 ED50为0.028 U·g－1，95%置信区间为0.012～0.066 U·g－1，用量与曲线下面积变化率相关方程为 ^Y=0.04479+0.55421/(1+101.626(0.1427－x))，r=0.967。

3 讨论

临床流行病学调查原发性痛经，发现我国寒凝血瘀型痛经的比例高、危害大，迄今没有特异性西药，针对其“寒冷”和“疼痛”两大症状群［2］，实验分析静脉给予异丙肾上腺素诱导产热和催产素诱导宫腔内压的量效关系，为原发性痛经寒凝血瘀证药效评价奠定基础。

实验中异丙肾上腺素诱导产热采用乙醚麻醉，大鼠清醒状态下准确反映机体产热状态;催产素诱导宫缩采用水合氯醛麻醉，由于乙醚有轻微舒张平滑肌的作用，且浅麻醉下大鼠挣扎剧烈，压力曲线出现杂峰干扰，因此，压力和温度分别检测。由于预实验发现压力检测时子宫出现适应性舒张，因此采取催产素注射前后各观察记录30 min压力曲线，且用药前恢复子宫功能状态5 min，可减少此因素的影响作用。检测方法稳定后，对异丙肾上腺素或催产素的对数剂量与曲线下面积变化率用Prism-4统计软件分析，获得半效剂量。

Tab 1 Thermogenesis induced by ISO in rats with primary dysmenorrhea±s，n=4)

Tab 1 Thermogenesis induced by ISO in rats with primary dysmenorrhea±s，n=4)

lg［ISO］δS 1.81 0.0150 ±0.0006 1.90 0.0107 ±0.0004 2.00 0.0227 ±0.0009 2.10 0.0101 ±0.0004 2.19 0.0173 ±0.0007 2.29 0.0318 ±0.0012 2.39 0.0372 ±0.0014 2.48 0.0475 ±0.0018 2.58 0.0515 ±0.0020

Tab 2 Uterine pressure induced by OXT in rats with primary dysmenorrhea(±s，n=4)

lg［OXT］δS 0.80 0.0580 ±0.0027 0.93 0.0488 ±0.0023 1.05 0.1820 ±0.0086 1.18 0.1021 ±0.0048 1.30 0.2035 ±0.0096 1.43 0.3069 ±0.0145 1.55 0.4465 ±0.0211 1.68 0.4038 ±0.0191 1.80 0.5490 ±0.0259

Fig 1 Thermogenesis induced by ISO in rats with primary dysmenorrhea(±s，n=4)

Fig 2 Uterine pressure induced by OXT in rats with primary dysmenorrhea(±s，n=4)

成人与啮齿类动物热稳态的最大区别是棕色脂肪消退，由其它细胞替代产热，即整体总产热功能从儿童期棕色脂肪向成人期非棕色脂肪细胞转移。手术切除肩胛骨间棕色脂肪并给予甲状腺机能抑制药物的大鼠，将导致机体产热机能下降，出现全身及局部的产热不足;乙烯雌酚可促进子宫内膜增生，增强子宫肌层收缩，提高子宫对催产素的敏感性。催产素对子宫平滑肌有选择性兴奋作用，可使子宫收缩增强;子宫内膜体积增加和收缩加强，出现子宫张力增大，痉挛收缩导致剧烈疼痛。本实验中雌激素己烯雌酚用量采用文献报道［9］小鼠用量 2 μg·g－1转化为大鼠 1 μg·g－1造成子宫内膜增生;异丙肾上腺素诱导模型大鼠适应性产热最适剂量较文献报道剂量［7］升高，提示了模型的寒症特征;催产素诱导子宫痉挛性收缩的最适剂量较文献报道剂量［10］转化大鼠剂量略有升高，可能与本模型的寒症有关，或者是催产素的生物学效能存在差异。研究异丙肾上腺素诱导适应性产热和催产素诱导子宫痉挛的最适剂量，可作为原发性痛经两大症状疗效评价的准确指标。

本研究建立了肩胛骨间棕色脂肪、切除联合丙硫氧嘧啶抑制产热和雌激素促进子宫内膜增生的原发性痛经寒凝血瘀证的大鼠模型;在造模大鼠上，确定了异丙肾上腺素诱导适应性产热和催产素诱导子宫痉挛的最适剂量，可作为评价原发性痛经痉挛性疼痛程度及其受局部温度影响的准确指标，探索了定量研究方法的具体实施条件，有益于提高中西医结合诊治疗疾病的准确性，为妇科药理学或证候药理学积累了实验资料。

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