链霉菌次生代谢中A因子级联调控研究进展

杨红文

谭 勇

(石河子大学药学院，新疆 石河子 832000)

链霉菌次生代谢中A因子级联调控研究进展

杨红文

谭 勇

(石河子大学药学院，新疆 石河子 832000)

A因子、Bld因子在灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)和其它链霉菌及非链霉菌放线菌中广泛存在，在链霉菌及相关放线菌的形态分化和次生代谢调控中有关键作用。A因子通过A因子-Arp-AdpA级联对多种链霉菌的次生代谢和形态分化有促进作用；Bld因子本质为tRNALeu-UUA，通过在翻译水平上调控含UUA密码子基因的表达来促进形态分化和次生代谢，A因子调控级联中的adpA也是Bld因子调控的靶基因之一。

链霉菌(Streptomyces)；次生代谢；A因子；Bld因子

A因子(Autoregulator)是链霉菌及非链霉菌放线菌中广泛存在的γ-丁酸内酯及其衍生物，最先发现于灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)，在链霉菌次生代谢及形态分化调控中起关键作用，被称为链霉菌的“激素”。A因子通过对其本身及下游级联调控因子的表达调控全局性调控链霉菌抗生素的合成及菌丝分化和孢子形成。Bld因子是另一个链霉菌次生代谢和形态分化的调控因子，其缺失会导致气生菌丝不能形成，而只有凸形的菌落(bald)，但其调控机制和A因子有较大差异，同时它们的调控联系密切。近年来，这2个因子在链霉菌次生代谢和形态分化调控中研究较为深入，在此加以综述，希望能为它们的进一步深入研究有所裨益。

1 灰色链霉菌中的A因子调控级联和BldA调控

链霉菌有独特的形态分化发育周期，而次生代谢在其发育末期形成气生孢子时开始，二者有内在的关联，A因子调控级联和BldA因子在链霉菌形态分化和次生代谢调控中有关键作用。

A因子-Arp-AdpA类调控系统在链霉菌中广泛存在，一般的调控方式是：伴随着链霉菌的生长，链霉菌菌丝内的A因子合成逐渐积累，或者向培养基添加A因子类似物，达到一定量的A因子特异结合其受体蛋白(Arp类)并使后者变构从AdpA(一种A因子依赖基因)的上游调控序列上脱落下来，解除Arp蛋白对AdpA的转录抑制，而AdpA则直接或间接调控各种次生代谢和形态分化,也参加部分基础代谢。bldA基因的产物tRNALeu-UUA，是链霉菌中编码Leu的稀有密码子UUA的唯一tRNA，在翻译水平上参与含Leu(UUA)的基因的表达调控，包括次生代谢和形态分化的相关基因，如A因子级联中AdpA含有Leu(TTA)密码子，受其翻译调控。而参与基础代谢的基因中通常都没有Leu(TTA)密码子，说明其专一调控次生代谢和形态分化[1]。

在灰色链霉菌中，AfsA(A因子合成酶)以脂肪酸合成中的β-酮酸和一种甘油衍生物为前体参与催化A因子的形成[1]。当灰色链霉菌中的A因子积累到一定量时，可以特异接合ArpA并使其从AdpA的上游调控序列上脱落下来而使AdpA恢复转录，AdpA又结合链霉素合成调控基因strR的上游激活序列(UAS)促进其表达，StrR又促进链霉素合成基因的表达和链霉素产量的增加。其中ArpA抑制AdpA转录，在arpA缺失体中，链霉素合成增加，气生菌丝形成提前；而arpA的增加表达突变体MK2(Trp119Ala)则不产链霉素且不形成气生菌丝，但可以被位于外源启动子后的AdpA所恢复；并且AdpA是ArpA的唯一调控目标基因；同时，arpA缺失体并不影响A因子的合成，但A因子的合成受AdpA的两步反馈抑制[2]。而AdpA是通过结合strR上游的-270和-50两个位点促进其转录的，在adpA缺失体中，将strR启动子换成组成型启动子，即使没有AdpA，strR也可以转录，链霉素也可以正常合成，说明了AdpA对strR转录的调控关系[3]。

AdpA的结构分析表明，它可以其N端的ThiJ/PfpI/DJ-1类聚合域以二聚体形式存在，而在其C端则有2个结合DNA的HTH结构域，其结构上属于AraC/XylS调控子家族[4]，表明可能具有自我调控表达功能，在其基因上有3个AdpA的结合位点，结合AdpA的位点1(-100)和位点2(启动子区)可形成stem-loop阻碍RNA聚合酶进入起始adpA的转录，位点3(+80)和位点1、2相对独立，可能阻碍转录的延伸，位点1或位点3的突变体adpA的转录均增加，链霉素产量也显著提高[5]。

AdpA参与灰色链霉菌形态分化调控主要通过调控特定基因表达进行。SgmA是一种含锌的蛋白内切酶，AdpA可以结合sgmA上游序列促进其转录，sgmA缺失体的气生菌丝形成推迟半天，推测SgmA可能参与分解基内菌丝为气生菌丝的生长提供营养[6]。AdpA还参与AmfR对气生菌丝形成的调控，可以结合amfR上游2个位点促进其表达；amfR的转录还受sigma因子AdsA的负调控，adsA缺失体中amfR的转录持续在气生菌丝形成后比野生型多1 d；amfR含TTA密码子，说明其可能也受BldA的翻译调控，而AmfR还有1个保守的Asp-54残基，可能受翻译后激酶磷酸化调控；AmfR通过结合amfT启动子上游序列激活多顺反子amfTSBA转录，进而参与气生菌丝形成[7]。

AdpA还参与灰色链霉菌中次生代谢和形态分化外的基础代谢调控。AdpA可以结合胰凝乳蛋白酶基因sprA、sprB、sprD上游序列促进它们的转录，而sprAB和sprABD缺失体的气生菌丝和孢子形成均同野生型[3]。

灰色链霉菌的adpA和strR中也有TTA密码子，暗含它们也受BldA的翻译调控，bldA缺失可导致气生菌丝形成缺陷和不产链霉素。

2 天蓝色链霉菌中A因子调控级联和BldA调控

天蓝色链霉菌(S.coelicolor)中的A因子级联调控和灰色链霉菌中有所不同。最大的不同是adpAc(bldH)的转录不受A因子-ArpA调控(至少在液体培养中是这样)，而其翻译因adpAc含TTA密码子而受BldA控制，其突变(TTA-gt;TTG)可使bldA突变体秃型部分恢复(形成部分气生菌丝)，也说明在气生菌丝形成中，受BldA控制的除了adpAc，还有其它基因参与[8]。

第二个不同是，天蓝色链霉菌中A因子结构类似物SCB1的合成基因scbA和Arp结构类似物基因scbR独特的相互表达调控。ScbR在scbA和scbR上游都有结合序列，添加SCB1可使ScbR的DNA结合活性丧失，而scbR缺失体不能合成SCB1，提示ScbR正调控scbA的转录；另一个ScbR超量表达的突变体中，scbR的转录被消除，说明ScbR抑制自身表达而激活scbA的转录；scbA突变体中，scbA和scbR转录都减少，添加SCB1后，scbR转录得以恢复，而scbA转录不能恢复，说明SCB1对scbR转录的正调控作用，而scbA的转录除了需要SCB1，还需要ScbR的参与,而在灰色链霉菌中，A因子的合成和afsA的转录却受AdpA的两步反馈抑制；另外scbR缺失体不能合成SCB1，也迟滞了十一烷基灵菌红素(Red)的合成，而不是像灰色链霉菌arpA缺失体使Str提前形成或超量合成；scbA缺失体除了不能合成SCB1外，却使放线紫红素(Act)和十一烷基灵菌红素(Red)超量合成，这和灰色链霉菌中afsA缺失体不能合成链霉素不同[9]。

Arp在天蓝色链霉菌中的结构类似物ScbR包含DNA结合域和有疏水穴的A因子类结合的调控域，当A因子结构类似物SCB1结合调控域后，引起2个结构域间的氨基酸残基的构象发生变化，进而使DNA结合域在重新定位时脱离调控序列，解除对次生代谢和形态分化的负调控[10]。

A因子对孢子萌发率也有影响，外加A因子可使原来合成A因子的S.griseus773和S.coelicolorA(3)2孢子萌发率提高60%～70%，而对原不合成A因子的S.avermitilisJCM5070则不影响孢子萌发率[11]，在萌发时，孢子内A因子还没有开始大量合成，含量很少，却也存在其刺激孢子萌发的机制。

BldA也参与天蓝色链霉菌的次生代谢调控，放线紫红素(Act)的途径专一性激活基因actII-ORF4和负责Act输出的actII-ORF2中都有TTA密码子，因而其bldA突变株不产放线紫红素；而十一烷基灵菌红素(Red)的途径专一性调控基因RedD中并没有TTA密码子，但位于其上游的激活因子redZ中则有TTA密码子，BldA可能通过RedZ-RedD途径参与调控Red的合成调控[12]。

3 其它链霉菌中的A因子调控级联和BldA调控

在变铅青链霉菌(S.lividans)中，A因子结构类似物SCB1合成由scbA负责，scbA缺失体消除了SCB1的合成和其正调控的Act、Red的合成，而转入并表达次生代谢途径专一性调控基因actII-ORF4和redR后，Act和Red产量都恢复到野生型水平，说明变铅青链霉菌中次生代谢也是由A因子结构类似物间接调控途径专一性调控基因进行的[13]。在变铅青链霉菌的形态分化中，气生菌丝专一的细胞分裂基因ssgA参与气生菌丝隔膜形成和孢子形成，其缺失体仅形成气生菌丝而不产孢，AdpA参与ssgA的转录调控，ssgA有3个AdpA结合位点，当AdpA结合位点1(-235)和位点2(-110)可以激活ssgA的2个启动子P1(-124)、P2(-79)进行转录，位点3(+60)对ssgA转录调控作用不大，除了AdpA，sigma因子AdsA也参与ssgA的转录调控[14]。BldA也调控参与变铅青链霉菌形态分化的Ram家族表达，增加Ram家族拷贝数可加速形态分化，而ramABR缺失体却不能形成气生菌丝和产孢，ramR由单一启动子稳定转录，RamR再结合单顺反子ramCSAB上游序列促进它们的转录，Ram家族的表达受BldA、BldB、BldD、BldH的翻译控制，它们的缺失都使ramR和ramCSAB不能表达，说明Ram家族也处于BldA和A因子级联的调控之下，可能是ramR含TTA密码子而受BldA的翻译控制，也可能是ramR转录受BldA翻译控制的AdpA的调控[15]。AdpA也影响与形态分化无关的菌落形态，变铅青链霉菌因其中pIJ702上的melC操纵子可产黑色素而呈现暗褐色菌落，但S.lividansZX66中pIJ702碱基突变A-gt;C导致了氨基酸残基发生Thr-gt;Pro的变化，使melC表达和黑色素合成不能进行而呈现白色菌落，而向其中转入含adpAc的3.3 kb的DNA片段却可以恢复黑色素合成和暗褐色菌落形态，说明melC操纵子是AdpAc直接调控的一个分支[16]。

阿维链霉菌(S.avermitilis)能通过次生代谢合成阿维菌素、伊维菌素等高效低毒农用杀虫剂，阿维菌素高产菌株的基因工程构建依赖于对阿维链霉菌次生代谢调控网络的深入研究，在阿维菌素合成调控中，AveR为阿维菌素合成正调控基因，将aveR多拷贝转入阿维链霉菌可使阿维菌素产量提高约一倍左右[17]，而aveR转录受于A因子-Arp-AdpA级联正调控，阿维链霉菌中还存在AdpA的结构类似物AdpA-a，也具备AdpA的部分调控功能，adpA-a的双交换缺失突变株形态分化受阻，也不再产生黑色素，但阿维菌素合成不受影响，通过基因互补可使突变株形态分化和黑色素合成能力恢复[18]。bldAa在阿维菌素合成和形态分化中也有影响，其基因置换缺失体不再产生气生菌丝，同时阿维菌素合成能力也丧失，进一步研究发现阿维菌素合成基因簇aveA3及其合成正调控基因aveR中都有亮氨酸TTA稀有密码子，提示其翻译受BldAa调控[19]。

在维基尼链霉菌(S.virginiae)中，维基尼霉素(virginiamycin)合成受Arp结构类似物BarA的负调控，BarA的第二个DNA结合域HTH缺失使维基尼霉素合成提前6 h，但形态分化不变，同时A因子结构类似物VB合成被消除，说明BarA同时正调控VB的合成，这和天蓝色链霉菌中ScbR正调控SCB1的合成有相似之处；而BarA的C端缺失体在VB存在时也不合成维基尼霉素，其C端可能有VB的结合区，处于barA下游的barB产物也调控维基尼霉素的合成，其大部分编码区的缺失体使维基尼霉素M(1)和S的合成在VB合成后早于野生型2～3 h，说明BarB可能参与VB产生后维基尼霉素合成的迟滞过程，同时该缺失体的形态分化和VB合成没有显著变化，说明BarB并不参与形态分化和VB合成调控[20]。在VB的合成中，BarS1催化6-脱氢-VB向VB的转化，并且对底物识别有立体异构特异性，其缺失体不能合成VB和维基尼霉素，但维基尼霉素合成可由向培养液添加VB而恢复[21]。

在带小棒链霉菌(S.clavuligerus)中，次生代谢产物头孢霉素(Cephamyci C)和棒酸(Clavulanic acid)合成也受A因子级联的调控。其Arp结构类似物Brp可以结合头孢霉素和棒酸合成的共同正调控基因ccaR上游序列(ARE)抑制其转录，进而抑制头孢霉素和棒酸的合成，其缺失体棒酸和头孢霉素的产量分别为原来的150%～300%和120%～220%，而Brp在带小棒链霉菌中是以二聚体形式存在的[22]。同时CcaR除了结合头孢霉素和棒酸合成基因簇中的双向启动子cefD-cmcI促进它们转录和次生代谢外，还可以结合自身的启动子上游ARE序列进行自我表达调控[23]。Bld因子中的bldG也参与次生代谢和形态分化调控，它编码一种anti-anti-sigma因子，其缺失体中头孢霉素和棒酸的共同调控基因ccaR和棒酸途径专一正调控基因claR转录均受抑而不能合成这2种次生代谢产物，同时形态分化也缺陷[24]。

始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)可以合成次生代谢产物普纳霉素(pristinamycin)，它的Arp结构类似物SpbR可以结合普纳霉素合成正调控基因papR1上游序列而抑制其转录并抑制普纳霉素的合成，其缺失体的形态分化、普纳霉素合成均缺陷，同时SpbR的DNA结合活性可以被A因子结构类似物所抑制[25]。

唐德链霉菌(S.tendae)ATCC 31160可以合成尼克霉素，其Arp结构类似物TarA被Tn4560插入失活后尼克霉素不再合成，而其结合DNA的HTH区被红霉素抗性基因(ermE)替代后，不能再结合DNA，推迟了尼克霉素的合成，同时被破坏的tarA转录量增加，说明TarA负调控自身的转录，也正调控尼克霉素的合成，这和一般的Arp类抑制次生代谢不同[26]。

在淡紫灰链霉菌(S.lavendulae)FRI-5中，A因子结构类似物IM-2和Arp结构类似物FarA参与核苷类抗生素丝裂霉素C的合成调控，farA缺失体在液体培养时丝裂霉素C合成提前，说明FarA负调控次生代谢[27]。

4 非链霉菌放线菌中的A因子调控

A因子级联系统并非只存在于链霉菌中，用A因子类(S.lavendulaeFRI-5的IM-2，S.virginiae的VB和S.griseusHH1的A因子)从替考游动放线菌(Actinoplanesteichomyceticus) 和地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)的细胞裂解物中检测到了A因子类结合活性，说明A因子类级联调控可能在这些非链霉菌放线菌中也存在[28]。在非链霉菌放线菌(Kitasatosporasetae)中也发现了Arp的结构类似物KsbA，其缺失体形态分化不变，但次生代谢产物巴佛洛霉素(bafilomycin)合成提前了18 h，产量也提高了24%，而引入KsbA后又可恢复到野生型水平[29]。

5 展望

A因子调控级联和Bld因子在链霉菌复杂的次生代谢、形态分化及对环境因子应激的调控网络中居于核心地位，在非链霉菌放线菌中也广泛存在，对其在各种放线菌中调控机制的进一步深入研究，将为研发新型、高效和高产的抗生素工程菌株及阐述链霉菌内在的基因表达调控网络奠定坚实基础。

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2009-09-17

杨红文(1975-)，男，河南渑池人，理学博士，讲师，从事链霉菌分子生物学、动物功能基因组学及中草药饲料添加剂研究.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.019

Q935

A

1673-1409(2010)01-S074-05