一种新型多吡啶钴(Ⅲ)配合物的合成、表征与DNA的相互作用

谭年元,蒋 燕,肖小明 *,陈立新,颜炜伟,黄赛金

(1.湖南工程学院化学化工学院, 中国 湘潭 411104; 2.湖南师范大学化学化工学院, 中国 长沙 410081)

近年来，过渡金属多吡啶配合物与DNA的相互作用已成为无机生物化学领域十分活跃的研究课题[1-6]．过渡金属多吡啶配合物广泛地被研究用作DNA结构探针、DNA分子光开关、DNA光裂解试剂以及抗癌药物等[1-4]．含配体dppz(dipyrido[3,2-a; 2′,3′-c ]phenazine, 二吡啶吩嗪)的多吡啶钌配合物[RuL2dppz]2+(L=2,2′-bipyridine, 1,10-phenanthroline)在有机溶剂中可产生荧光，而在水溶液中，由于配体与水分子存在氢键作用，从而猝灭了插入配体的激发态．当加入DNA后，配体dppz插入DNA碱基对中，吩嗪N受到保护而脱去缔合水而又有荧光出现，此效应称为“光开关”[3-4]．

图1 配体dpapz的结构

为进一步研究该类配合物与DNA的键合性质，吴宝燕等[7]合成了一种在dppz骨架上引入另一个氮原子的配体联吡啶并[3,2-a: 2′,3′-c ]6-氮杂-吩嗪(dpapz，结构如图1所示)的多吡啶钴配合物，他们发现该配合物与DNA键合作用较强，是一种良好的DNA嵌入键合试剂.本文合成了含该配体的多吡啶钴配合物，并测定了配合物的电化学行为，以及分别采用紫外、荧光和黏度法研究了配合物与小牛胸腺DNA的相互作用．

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AVATAR-370红外光谱仪(美国Nicolet公司)、Vario-EL Ⅲ元素分析仪(德国Elementar公司)、CHI660B电化学工作站(上海辰华仪器公司)、 Agilent-8453紫外可见分光光度计(美国Agilent公司)、F-4500荧光分光光度计(日立公司)、pHS-3C型精密酸度计(上海雷磁厂)、乌式黏度计．

[Co(bpy)2Cl2]Cl[8], dpapz[7]参照文献方法合成，小牛胸腺DNA(北京华美生化试剂试剂公司)，三羟甲基氨基甲烷 (Tris) (日本和光纯药工业株式会社)，高氯酸四丁基铵( Fluka公司)．其它试剂均为AR级, 所用试剂除特别说明外均没有进一步处理．

研究配合物与DNA相互作用时, 样品均溶解在含5 mmol·L-1Tris·HCl和50 mmol·L-1NaCl的二次蒸馏水缓冲溶液(pH=7.2)中，小牛胸腺DNA的浓度以ε260=6 600 L·mol-1·cm-1来确定[9]．

1.2 配合物的合成

1.3 分析方法

1.3.1 电化学测定 配合物的电极电位用循环伏安法测定．采用三电极系统，工作电极为玻碳电极，使用前先用0.05 μm的Al2O3糊在抛光垫上抛光，然后依次在丙酮、二次蒸馏水中超声清洗10 min，辅助电极为铂电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)．溶剂为乙腈，使用前用P2O5重蒸2次，支持电解质为高氯酸四丁基铵(TBAP，0.1 mol·L-1)．测试前通高纯氮15 min除氧．

1.3.2 配合物与DNA作用的电子吸收光谱 在参比池加入2.5 mL Tris缓冲溶液，在样品池中加入相同体积的6 μmol·L-1的配合物溶液，用微量加样器每次往参比池和样品池中加入相同体积的DNA溶液，使DNA与配合物浓度比值不断增加，直至吸收峰不再减色．

1.3.3 配合物与DNA作用的荧光光谱 在样品池中加入2.5 mL 6 μmol·L-1的配合物溶液．用微量加样器每次往样品池中加入相同体积的DNA溶液，使DNA与配合物浓度比值不断增加，以适当波长激发光激发，测定配合物的发射光谱．

1.3.4 DNA黏度测定实验 温度恒定在(28±0.1)℃，小牛胸腺DNA浓度固定为0.4 mmol·L-1，依次增大配合物浓度．相对黏度按公式η= (t-t0)/t0[t0为缓冲溶液流经毛细管所需时间，t为DNA溶液(含浓度不等的钴配合物)流经毛细管所需的时间]计算[10]．以(η/η0)1/3对结合比率r作图(r= [Co]/[DNA])，η0为未加配合物时DNA溶液的相对黏度．

2 结果与讨论

2.1 配合物的电化学性质

配合物在乙腈中的循环伏安曲线如图2所示．由图2可知，在-0.1～0.7 V电位范围内，配合物有一对氧化还原峰，其阳极峰电位和阴极峰电位分别为Ep,a=0.415 V和Ep,c=0.266 V, 对应的电极反应是Co(Ⅲ)/Co(Ⅱ)的氧化还原过程．阳极峰电位和阴极峰的电位差ΔEp=0.149 V，其峰电流对扫描速率(0.02～0.2 V/s)的平方根作图(图2)，可得一条通过原点的直线，故认为该氧化还原反应为准可逆单电子过程．

2.2 配合物与DNA作用的电子吸收光谱

配合物与DNA相互作用的电子吸收光谱如图3所示．由图3可知，随着DNA浓度增加，配合物在221，274，307和368 nm处的吸收峰均发生明显的减色，减色率分别为24.2%、35.6%、13.2%和37.0%，表明得到的配合物可能以插入方式与DNA键合[11]．这是因为插入配体与DNA碱基对发生π电子堆积之后，配体的π*空轨道与碱基的π电子轨道发生偶合，偶合后的π轨道因部分填充电子，使π→π*跃迁几率减小，产生减色效应．配合物与DNA的键合常数Kb可根据下列方程式求得[12]：

cDNA/(εf-εa)=cDNA/(εf-εb)+(1/Kb) (εf-εb)，

其中，cDNA表示DNA的浓度，εa、εb和εf分别表示任意DNA浓度下、键合饱和以及未加DNA时配合物的摩尔吸光系数，以cDNA/(εf-εa)对cDNA作图(图3)，所得直线的斜率与截距的比值即为配合物与DNA的键合常数Kb=1.49×105L·mol-1．

图2 配合物[Co(bpy)2dpapz]3+在乙腈中的循环伏安曲线，扫描速率为100 mV/s 图3 配合物[Co(bpy)2dpapz]3+在不同DNA浓度下的电子吸收光谱

2.3 配合物与DNA作用的荧光光谱

荧光光谱变化幅度的大小也能反映配合物与DNA作用的强度．以240 nm波长的光进行激发，测得配合物的荧光光谱如图4所示．在Tris溶液中，配合物没有荧光，这是由于配体dpapz与水分子之间存在氢键作用，从而猝灭了插入配体的激发态[7]．加入DNA后，配合物的插入配体dpapz插入DNA碱基对中，吩嗪N受到保护脱去缔合水而产生发射波长为331 nm的荧光，且随DNA浓度的增大，强度明显增大，表明配合物与DNA作用较强，与紫外光谱结果一致．

2.4 配合物与DNA作用的黏度测定

黏度测定是确定配合物与DNA键合模式的最有效的方法之一．当配合物以静电、沟面结合等非插入方式与DNA作用时，DNA溶液的黏度无明显变化；当配合物通过经典插入方式与DNA作用时，DNA相邻碱基对的距离变大以容纳插入配体，导致DNA双螺旋伸长，DNA溶液的黏度增加；当配合物以部分插入方式与DNA作用时，则可能使DNA双螺旋发生扭结，使DNA溶液黏度减小[10]．从图5可知，随着配合物浓度增加，DNA溶液的相对黏度增大，进一步证实该配合物是以经典插入方式与DNA结合．

图4 配合物[Co(bpy)2dpapz]3+随DNA浓度增大的荧光光谱图 图5 DNA溶液的相对黏度随配合物[Co(bpy)2dpapz]3+加入量的变化

3 结论

合成了一种新型多吡啶钴配合物[Co(bpy)2dpapz](ClO4)3·H2O并对其进行了表征，用光学实验和黏度测试研究了该配合物与DNA的互相作用，结果显示该配合物以经典的插入方式与DNA结合，键合常数为1.49×105L·mol-1．

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