急性坏死性胰腺炎大鼠腹腔内压力和血TNF-α的时相改变

贾林 陈奕金 黄耀星 邱嘉华 杜洪

·论著·

急性坏死性胰腺炎大鼠腹腔内压力和血TNF-α的时相改变

贾林 陈奕金 黄耀星 邱嘉华 杜洪

目的探讨急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠模型的腹腔内压力和TNF-α的时相改变及其规律。方法80只SD大鼠按数字表法分为ANP组和对照组。采用4.5%牛磺胆酸钠胰管内逆行注射制备ANP模型，对照组注射等量生理盐水。制模后1、3、6、12、24 h分批各处死8只大鼠，检测血淀粉酶、TNF-α水平，测定腹水量和腹腔内压力，并观察胰腺病理改变。结果ANP大鼠血淀粉酶含量呈进行性升高，24 h时高达对照组的32倍；血TNF-α水平也显著升高，6 h时达到峰值，为对照组的18倍；制模后1 h起腹水量开始增多，于24 h达到高峰，约为对照组4.7倍；制模后1 h起腹内压力明显升高，3 h时约为对照组的3倍，12 h约为对照组的9倍；胰腺病理损伤进行性加重，24 h损伤最严重。结论ANP大鼠存在明显腹内高压，制模后12 h腹内压最高，炎症介质TNF-α升高高峰为制模后6 h，故腹内高压可能为炎症反应的后续反应。

胰腺炎，急性坏死性； 压力； 肿瘤坏死因子α； 大鼠

随着重症患者腹内高压(intra-abdominal hypertension，IAH)和腹腔间隔室综合征(abdominal compartment syndrome，ACS)诊治研究的不断深入，重症急性胰腺炎(SAP)并发IAH越来越引起临床医师的重视，其与SAP病情严重程度、脏器功能衰竭、治疗方法的选择、住院时间和患者预后密切相关[1-4]。但国内外均未见SAP并发IAH/ACS与炎症介质时相关系的研究报道。本文通过动态监测急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠的腹腔内压(intra-abdominal pressure，IAP)、胰腺病理评分及促炎因子TNF-α等指标的时相变化，探讨它们的变化规律。

材料与方法

一、实验动物及分组

健康雌性SD大鼠96只，体重200～250 g，清洁级，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2008-0020。按数字随机法将大鼠分为对照组和ANP组，各40只。采用胰管内逆行注射4.5%牛磺胆酸钠(Sigma公司)1 ml/kg体重的方法诱导大鼠ANP模型；对照组注射等量生理盐水。术后1、3、6、12、24 h分批各处死8只大鼠。

二、血清淀粉酶、TNF-α水平检测

鼠尾静脉采血，用抗凝液混匀后置-70℃冰箱。淀粉酶检测采用酶联耦合法，TNF-α检测采用ELISA法，试剂盒购自美津生物公司。

三、大鼠腹内压测定

测压用的BL-420E+生物机能实验系统由广州医学院机能实验室提供，包括生物信息采集仪、压力换能器、电脑和系统软件、改良的冠状动脉扩张球囊(距球囊顶端20 cm处用锐刀将导管截断，导管断端与硬膜外导管接头的一端连接，该接头另一端连接注射器，进行导管球囊内液体的注入和抽出)。

大鼠麻醉后取平卧位，左下腹穿刺，冠脉扩张球囊导管内充注生理盐水，将连接球囊导管的硬膜外导管接头的另一端连接压力换能器。应用压力换能器与生物机能实验仪，以腋中线为“0”点，大鼠呼气末时换能器所感受的压力就是球囊内压和腹内压。

四、腹水量检测

观察腹水的颜色，用称重的干棉球吸尽腹水，再称重。腹水量=湿棉球的重量-干棉球的重量。

五、胰腺病理检查

取胰腺组织于10%甲醛缓冲液固定，常规脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，由专一病理科医师观察切片，并按Schmidt等[5]的标准进行评分。

六、统计学处理

结 果

一、血清淀粉酶和TNF-α的时相变化

ANP大鼠血淀粉酶含量进行性升高，均显著高于同时点对照组(P值均lt;0.01)，1 h时为对照组的13倍，24 h时达对照组的32倍。血TNF-α水平也显著高于同时点对照组(P值均lt;0.01)，6 h时达到峰值，为对照组的18倍(表1)。

二、大鼠腹水量和腹内压的时相变化

对照组偶见少量黄色清亮腹水。ANP组1 h时的腹水黄色清亮，3 h时为红色或暗红色；1 h起腹水量开始增多，且随着建模时间延长腹水量逐渐增加，于24 h达到高峰，约为对照组4.7倍(表1)。

ANP组自1 h起腹内压就明显升高，并随时间延长进行性升高，3 h时约为对照组的3倍；12 h达到峰值，约为对照组的9倍(表1)。

三、胰腺病理损伤的时相变化

对照组胰腺外观均无明显改变。ANP大鼠1 h时见胰腺水肿，腹腔少量淡黄色腹水；3 h时胰腺表面可见散在出血点，腹水逐渐增多；6 h时胰腺表面、胰周脂肪及网膜点状出血，有少量淡血色腹水；12 h和24 h出现胰腺片状坏死，胰周及网膜点状皂化斑，血性腹水明显增加。

镜下对照组胰腺均未见明显水肿、出血和细胞坏死。ANP大鼠1 h时见胰腺腺泡轻度水肿，无出血和腺泡脂肪坏死；3 h出现胰管边缘轻度炎症和周围腺泡轻度破坏、无或少量出血；6 h出现腺泡散在坏死灶、小叶间隙增大，胰管坏死区边缘炎性细胞渗出明显，间质出血和脂肪细胞坏死；12 h和24 h小叶轮廓模糊不清，见腺泡大片灶性坏死，间质弥漫性出血。ANP大鼠胰腺病理评分均值均高于同时点对照组，24 h达到峰值，约为对照组的6.4倍(P值均lt;0.05，表1)。

讨 论

危重患者并发IAH/ACS早在上世纪80年代就已经引起国外学者的重视，但由于缺乏共识定义致IAH/ACS的概念混淆，各地研究结果也难以相互比较。直至2007年，世界腹腔间隔室综合征协会(WSACS)在比利时召开了第三届国际ACS专题会议，并达成了IAH/ACS的共识定义、IAP标准检测技术和具有循证医学证据的临床诊治指南[6]。该指南指出，病理性IAP是一个包含从IAP轻度升高到伴有重要脏器严重损伤的持续性IAP升高的连续范畴，IAP升至10～15 mmHg(1 mmHg=0.133kPa)时便可出现肾、心和胃肠道功能损伤。该指南将出现持续或反复的IAP病理性升高≥12 mmHg定义为IAH；持续IAPgt;20 mmHg并伴有新的器官功能不全或衰竭则定义为ACS。

表1 各组大鼠的血清淀粉酶、TNF-α以及IAP等指标的动态变化

注：与对照组比较,aPlt;0.05，bPlt;0.01;1 mmHg=0.133 kPa

De Waele等[1-2]系列研究发现，重症监护病房的SAP患者并发IAH较为常见，且多伴发器官功能不全、高APACHEⅡ和Ranson评分以及高死亡率，其中IAH和ACS的并发率分别为60%～80%和27%；SAP并发ACS的死亡率高达50%～75%。SAP并发IAH与脏器功能衰竭之间的直接因果关系迄今尚未明了。由于SAP患者并发IAH/ACS的临床病例相对不足，当前非常需要制备相关的动物模型进行病理生理学以及防治学研究[7-8]。

目前一般采用腹腔内灌入CO2或N2气体人为制造腹内高压模型，用于观察IAH对器官功能损害的影响。鉴于ANP大鼠本身可引起腹内压升高，故本文直接测量腹内压，动态观察ANP大鼠24 h腹内压、炎症介质和胰腺病理改变及其自然病程。结果显示，ANP大鼠的腹水量从建模后1 h开始增加；3 h后IAP明显升高，且进行性升高；24 h时腹水量和IAH达到高峰。表明SNP大鼠的确存在进行性腹内高压。同时血TNF-α水平在建模后也显著升高，6 h时达到峰值，随后一直维持在较高水平。

时相研究显示，IAP升高明显晚于促炎因子TNF-α的高峰时间，但与胰腺病理严重程度的时相改变基本同步。因此，我们有理由推测，IAP的进行性升高和胰腺炎症的不断加重均属于炎症反应的后续效应。目前针对TNF-α的早期治疗对腹内高压和SAP预后的改善价值正处于进一步研究之中。

[1] De Waele JJ,Leppä niemi AK.Intra-abdominal hypertension in acute pancreatitis.World J Surg,2009,33:1128-1133.

[2] De Waele JJ,Hoste E,Blot SI,et al.Intra-abdominal hypertension in patients with severe acute pancreatitis.Crit Care,2005,9:R452-R457.

[3] Al-Bahrani AZ,Abid GH,Holt A,et al.Clinical relevance of intra-abdominal hypertension in patients with severe acute pancreatitis.Pancreas,2008,36:39-43.

[4] Chen H,Li F,Sun JB,et al.Abdominal compartment syndrome in patients with severe acute pancreatitis in early stage.World J Gastroenterol,2008,14:3541-3548.

[5] Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.A better model of acute panereatitis for evaluating therapy.Ann Surg,1992,215:44-56．

[6] 贾林，陈奕金.WSACS关于腹腔间隔室综合征诊治的共识意见.中华急诊医学杂志，2009，18：443-444.

[7] Schachtrupp A,Wauters J,Wilmer A. What is the best animal model for ACS?Acta Clin Belg Suppl,2007,1:225-232.

[8] Wauters J,Wilmer A.Noosa,2 years later... a critical analysis of recent literature.Acta Clin Belg Suppl,2007,1:33-43.

2010-02-09)

(本文编辑：吕芳萍)

Time-coursechangesofintra-abdominalpressureandplasmaTNF-αinratswithacutenecrotizingpancreatitis

JIALin,CHENYi-jin，HUANGYao-xing，QIUJia-hua，DUHong.

DepartmentofGastroenterology,FirstMunicipalPeople′sHospitalofGuangzhou,GuangzhouMedicalCollege，Guangzhou510180，China

JIALin,Email:jialin@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the time-course change of intra-abdominal pressure (IAP), TNF-α in rat with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and its mechanism.Methods80 SD rats were randomly divided into ANP group and control group. ANP group was induced by retrograde injection of 4.5% sodium taurocholate into the pancreatic duct in SD rats, while control group was induced by injection of saline at the same dosage. Eight rats in each group were killed at 1 h, 3 h, 6 h, 12 h and 24 h, respectively. The serum levels of amylase, TNF-α were determined; IAP, amount of abdominal ascites, pancreatic pathologic changes were evaluated.ResultsThe levels of amylase in ANP group increased progressively with time, which were 32-folds higher than those in control group at 24 h. The serum levels of TNF-α in ANP group reached the peak at 6 h, and were significantly higher than those in the control group. The amount of abdominal ascites increased post-ANP induction and reached the peak at 24 h, which was 4.7-folds higher than that in the control group. The IAP significantly increased 1 h after induction, which was 3 times as high as the control group in 3 h group and 9 times in 12 h group. Pathologic injuries deteriorated progressively and reached the peak at 24 h.ConclusionsSignificant IAP occurred in ANP rats and reached the peak at 12 h, TNF-α reached the peak at 6 h, therefore IAP may be the secondary response to inflammatory reaction.

Pancreatitis, acute necrotizing； Pressure; Tumor necrosis factor-alpha; Rat

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.011

广州市卫生局重点专科基金(2008-ZDi-02)

510180 广州，广州医学院附属广州市第一人民医院 广州市南沙中心医院消化内科(贾林、陈奕金、黄耀星、邱嘉华)，病理科(杜洪)

贾林，Email:jialin@medmail.com.cn