不同温度条件下棕尾别麻蝇的生长发育及其在法医学上的意义

汪海洋,时燕薇,刘小山,张润杰

(中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室/昆虫学研究所,广州 510275)

法医昆虫学(Forensic entomology)是应用昆虫学知识解决有关法律问题的法医学分支学科,对死亡时间的推断,特别是腐败尸体的死后间隔时间(postmortem interval,PMI)的推断具有无可比拟的优越性(Amendt et al.,2004)。根据尸食性蝇类蝇蛆日龄指标和生长发育速度是法医昆虫学中推断死亡间隔时间的一种方法,也是目前法医学或法医昆虫学中应用研究的热点(陈禄仕,2006)。由于昆虫在生长发育过程中须从外界摄取一定的热量才能完成发育历期,所需的积温在一定条件下是一个定值,而且昆虫具有特定的时空(季节性和区域性)分布特点(薜万琦和赵建铭,1987);这些特点对推断死亡时间、死亡地点、死亡原因等方面具有传统法医学所无法比拟的优势和重要意义。

棕尾别麻蝇 Boettcherisca peregrine隶属双翅目Diptera麻蝇科 Sarcophagidae别麻蝇属 Boettcherisca。幼虫主要在人粪、腐肉上孳生(杨玉璞和汪兴鉴,1998;陈禄仕,2001)。在我国,棕尾别麻蝇分布较广,除新疆以外的其余省市和地区都有分布,且在山西太原和呼和浩特为麻蝇类群的优势种(王晔等,2003;董迎春等,2009;蔡继峰等,2004;时燕薇等,2008)。在我国南方,棕尾别麻蝇可能是第一批到达尸体的种类,也是我国南方重要的一种尸食性蝇类(王江峰等,2001)。经我们的野外调查发现,在广州地区,棕尾别麻蝇幼虫经常在尸体上出现。因此,棕尾别麻蝇是一种重要的法医昆虫,它的生长发育数据可以用于推断死后间隔时间,又温度是影响昆虫发育的最关键因素之一,故本文探讨不同恒温处理对棕尾别麻蝇发育节律的影响,为法医昆虫学提供一些新的基础数据,并讨论所获结果的法医学意义。

1 材料与方法

1.1 供试虫源棕尾别麻蝇实验种群的获得

将兔尸置于野外(地点为中山大学生命科学学院南院鱼塘的隐蔽树丛后,经纬度：23°05′39.3″N,113°17′25.1″E,海拔 21.8 m)诱集尸食性蝇类 ,于第 2 d网捕麻蝇成虫。成虫(可能有多个麻蝇种)带回实验室后,置于网笼内,在 26±1℃,相对湿度70%,光周期 12 h：12 h条件下,饲以牛奶 、蜂蜜和水的混合物。由于麻蝇类难以根据雌成虫特征鉴定其种类,需要解剖雄成虫才能鉴定,故需获得单种雄虫确定所获成虫种类。获得单种雄虫的方法为：每笼(25 cm×25 cm×30 cm)置入 1头雌虫,以新鲜猪肉诱集幼虫。所获幼虫单独饲养至成虫,取出 5头左右雄虫进行鉴定,最终获得棕尾别麻蝇实验所需的初始种群。实验室繁殖 3代,第 4代幼虫用做实验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 收集幼虫

在智能型人工气候箱(MGC-350HP-2,上海一恒科技有限公司)饲养第 3代棕尾别麻蝇成虫 1周后,棕尾别麻蝇进入繁殖期,在繁殖高峰期将装有鲜肉的小烧杯放在网笼中,30 min后将带有幼虫鲜肉块取出。

1.2.2 温度设置

试验共设置五个温度 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃,温度误差为 ±1℃。在培养杯里铺上约 1～2 cm厚的干净细沙,喷洒适量水保持细沙湿度,放入 10 g鲜肉块,将诱得的幼虫放在鲜肉上,再将培养杯置于智能型人工气候箱(MGC-350HP-2,上海一恒科技有限公司)内,在光周期 12 h：12 h,相对湿度 70%的条件下饲养幼虫。每个温度处理重复 3次。

1.2.3 生长发育观察

成虫产幼虫后 30 min内将幼虫置于所设实验条件下饲养,以此时为该处理幼虫的生长发育零时,每隔 12 h观察、记录棕尾别麻蝇生长发育状况,测量幼虫的体长、体宽(测量方法如图 1所示)和体重,每个处理下每次取 10头幼虫,在 75℃左右的水中烫死,充分伸展后取出放在滤纸上,吸干虫体表面水分,用电子数显卡尺(Digimatic Caliper,Mitutoyo,Kawasaki,Japan)测量幼虫体长和体宽(Day and Wallman,2006),用电子天平(Max 120 g,d=0.0001 g,型号 BS124S,北京赛多利斯仪器系统有限公司)称重。

图 1 幼虫体长和体宽的测量示意图Fig.1 Axes of measurement of larval length and width(仿 Day＆ Walman 2005)

幼虫取食期间及时更换肉块,喷水,以保持适宜湿度;幼虫离食后(标准为幼虫不再取食,四处爬动,寻找化蛹位点),将肉块取出;幼虫化蛹后,每个处理至少取 20头蛹测长宽并称重,并记录幼虫开始化蛹时间、幼虫大量化蛹时间(当幼虫化蛹个数超过半数时)、开始羽化时间。开始羽化后停止测量蛹重。羽化后每天记录羽化数目至不再羽化。

1.3 计算方法

实验数据用 SPSS Statistics 17.0软件 (SPSS Inc.Chicago,Illinois,U.S.A)进行方差分析(ANOVA),平均数进行 Duncan's多重比较,显著水平 P=0.05。

2 结果与分析

2.1 不同温度下棕尾别麻蝇幼虫和蛹的生长发育

棕尾别麻蝇行卵胎生(Schroeder et al.,2003;王晔等,2003;杨玉璞和汪兴鉴,1998;陈禄仕,2001),成虫发育性成熟交配后,受精卵在雌虫体内发育成熟,并在体内孵化,遇到合适的生长条件产出,产出的幼虫为 1龄幼虫。本实验测得初孵幼虫平均体长为 1.73±0.03 mm,与陈禄仕(陈禄仕,2001)测得的平均长度 1.72 mm相符;发育至 3龄后期(即将离食时)幼虫个体各个日龄指标达到峰值,此时,15℃处理组幼虫体长、体宽和体重平均最值均为 5个温度处理中的最大值,分别为 17.16±0.62 mm,3.39±0.13 mm,0.0969±0.0083 g;化蛹后,20℃处理组围蛹长度最长,为 9.74±0.21mm,15℃处理组围蛹宽度最大,为 3.27±0.17 mm,重量也最大,为 0.0649±0.0038 g。上述结果的可能原因是,在 15℃处理中,温度较低,棕尾别麻蝇的幼虫生长期较长,达到 9.5 d,蛹期达到 22 d,较长的生长期使其能够取食更多的食物,个体能够长得更大;至于 20℃处理下围蛹的平均长度最长的原因尚需进一步研究。(如表 1)。

表1 棕尾别麻蝇幼虫离食期和化蛹初期在不同温度下的长度、宽度、重量Table 1 The length,width and weight of B.peregrine larva in the post-fooding stage and pupa at different temperatures

2.2 不同温度下棕尾别麻蝇的发育历期

在不同温度条件下,对棕尾别麻蝇不同发育阶段的观察表明：幼虫的发育历期先随着温度的升高逐渐缩短,超过最适温度 30℃之后,随着温度进一步的升高,发育历期有所延长;离食期也呈现出类似的情况;蛹的发育历期在 5个温度处理中随温度的升高而逐渐缩短(如表 2)。

2.3 不同温度条件下棕尾别麻蝇幼虫体长、体宽、体重、蛹重的时间动态

各温度处理下棕尾别麻蝇幼虫期的体长、体宽、体重和蛹期蛹重的时间动态如图 2～图 5所示：在成虫产卵到离食期这个生长阶段,幼虫的体长、体宽和体重与时间均呈直线关系(除 15℃处理由于温度偏低未呈直线关系);此后各处理组幼虫体长、体宽和体重随时间的变化曲线先上升,离食期后逐渐趋于平直,体重略有下降。就各处理下的幼虫体长、体宽、体重和围蛹重量与时间进行的回归分析表明这些指标与时间均呈三次曲线关系(如表 3),回归方程统计检验达到极显著水平(P＜＜0.01)。由图 2可看出温度对幼虫体长变化速率的影响大小顺序为 30℃＞35℃≈25℃ ＞20℃＞15℃,而体宽和体重表现出相似的情况。幼虫处于低龄时,35℃处理组的生长速率较 25℃处理组快;而在 3龄幼虫时,25℃处理组的生长速率比 35℃处理组快,图 2、图 3和图 4中的 25℃处理组和 35℃处理组的相应曲线都出现了相交现象,印证了这一结果。

表 2 棕尾别麻蝇在不同恒温下的发育历期Table 2 The durations of different stages for B.peregrine under various constant temperatures

表 3 不同温度下棕尾别麻蝇幼虫长度、宽度、重量和围蛹重量与生长时间的回归关系Table 3 The regression relationship between the average larval body length,width,weight and pupa weight of B.peregrine and growth time

(续上表)

图 2 不同温度下棕尾别麻蝇幼虫平均体长的时间动态Fig.2 Temporal dynamics of the average larval body length at different temperatures

图 3 不同温度下棕尾别麻蝇幼虫平均体宽的时间动态Fig.3 Temporal dynamics of the average larval body width at different temperatures

图 4 不同温度下棕尾别麻蝇幼虫平均体重的时间动态Fig.4 Temporal dynamics of the average larval body weight at different temperatures

图 5 不同温度下棕尾别麻蝇蛹平均重量时间动态Fig.5 Temporal dynamics of pupa weight of B.peregrineat different temperatures

3 结论与讨论

利用尸体上昆虫的生长发育情况来推断死后间隔时间是法医昆虫学的主要方法之一,国内外利用尸食性蝇类生长发育规律来推断死后间隔时间已有许多成功的案例。如 1985年美国南卡罗来纳州侦办人员根据案发现场收集到的蝇蛆和蛹,应用日龄指标成功地推测出被害人的死亡时间(胡萃主编,2000)。因此我们试图通过研究棕尾别麻蝇这种尸食性昆虫不同温度下的生长发育节律,获得相关日龄指标,以期为死后间隔时间的推断提供一些基础数据。

在尸体上发现有蝇类幼虫的情况下,可从尸体上采集蝇蛆,经幼虫鉴定若为棕尾别麻蝇,则可采集现场幼虫,用本文的方法测量其体长、体宽和体重,根据本文得出的幼虫在不同温度下体长、体宽和体重随时间变化曲线,以体长、体宽和体重的均值为纵坐标值,参照现场附近的温度查找相应生长曲线的横坐标值,即可得出蝇蛆生长时间,参考该地区该气候条件下麻蝇在尸体上产幼虫的时间数据,即可推算出人体死亡时间,为判断死亡时间、抓住破案时机提供一定的帮助。

对尸食性昆虫幼虫体长和体重的研究报道较多(Grassberger et al.,2003;Grassberger and Reiter,2001;王江峰等,2008;王江峰等,2002;王江峰等,2000;)。本实验也发现在取食期,幼虫体长和体重迅速增加,因而这一时期是较为理想的日龄指标。但在离食期,幼虫的体长和体重都会在一定程度上减小。虽然可以通过其它方法区分取食期和离食期幼虫,但体长和体重的变化不足以区分不同日龄的离食期幼虫,故不能作为一项有效的日龄指标(Greenberg and Szyska,1984)。

另外,在称蛹的过程中发现刚刚化蛹的 2～3 d,蛹重下降很快,每 12 h平均减少蛹重的 5.5±0.7%,此后趋于平缓,经历一个平台期后下降(羽化前一至两天),这与许兵红(许兵红等,2001)等人的研究结果相符。而胡萃认为,在化蛹的时候,由于蝇类主要是发生了一些生化变化,所以重量、长度变化并不明显。故蛹重这个指标本身的稳定性以及该指标对死亡时间推断是否具有参考价值尚需进一步研究(如图 5)。

就温度对各日龄幼虫体长、体宽和体重指标的影响而言,多数研究采用的温度处理均为恒温(Byrd and Allen,2001;王江峰等,2002;王江峰等,2000),而变温条件下蝇类的生长发育节律研究较少。此外,蝇类的新陈代谢及其速率不仅受环境温度影响,湿度、光照等因素也会协同影响蝇类的发育节律,因此,温度对蝇类发育速率的影响相当复杂。恒温与变温对蝇类发育的影响存在差异,此差异来源于温度与发育速率的非线性关系,而季节的影响及昆虫的适应性更增加了其变异性,不同季节出现的同一种蝇类对低温的耐受性存在差异,故综合考虑各种影响因素是必要的。解决方法之一是研究较多温度下各个指标与日龄的关系,应用时选用温度相差最小的模型。

本试验虽然设定了多个温度段,但整个实验过程中,温度却是恒定的,光照和湿度亦恒定不变,所以在实际应用棕尾别麻蝇的发育规律推测死后间隔时间(PMI)时,应结合当地的光照、降雨量、风速等环境情况进行综合分析。因此,如能在模拟的自然环境条件下进行蝇类幼虫的发育研究,将提高死后间隔时间(PMI)推断的准确性,这方面的工作有待于进一步开展。

致谢感谢中山大学生物博物馆梁铬球老师、贾凤龙老师在试验过程中帮助鉴定有关蝇类标本。

References)

Amendt J,Krettek R,Zehner R,2004.Forensic entomology.Naturwissenschaften,91(2)：51-65.

Byrd JH,Allen JC,2001.The development of the black blow fly,Phormia regina(Meigen).Forensic Science International,120(1-2)：79-88.

Cai JF,Tao T,Dong JG,Liu M,Liao ZG,2004.The study of the major sarcosaphagous flies in hohhot.Journal of Forensic Medicine,20(03)：133-135.[蔡继峰,陶涛,董建国,刘敏,廖志钢,2004.呼和浩特地区夏秋季常见嗜尸性蝇类的研究.法医学杂志,20(03)：133-135]

Chen LS,2001.Research on season distributing and metamorhosta of Boettcherisca peregrina with a view to estimating postmortem interval(PMI).Forensic Science and Technology,06：10-11.[陈禄仕,2001.棕尾别麻蝇的季节分布及虫态变化与死亡时间的研究.刑事技术,06：10-11]

Chen LS,2006.Determining postmortem interval by accumulated temperature method.Journal of Forensic Medicine,22(6)：438-438,458.[陈禄仕,2006.积温法则进行死亡时间推断.法医学杂志,22(6)：438-438,458]

Day DM,Wallman JF,2006.Width as an alternative measurement to length for post-mortem interval estimations using Calliphora augur(Diptera：Calliphoridae)larvae.Forensic Science International,159(2-3)：158-167.

Dong YC,Zhu Y,Wang L,Dong CZ,Liao ZG,2009.Primary study on common species sarcosaphagous flies in Sanmenxia area of Henan Provience.Forensic Scienceand Technology,02：14-16.[董迎春,朱怡,王磊,董春泽,廖志钢,2009.河南三门峡地区夏秋季常见嗜尸性蝇类的初步研究.刑事技术,02：14-16]

Grassberger M,Friedrich E,Reiter C.2003.Theblowfly Chrysomya albiceps(Wiedemann)(Diptera：Calliphoridae)as a new forensic indicator in Central Europe.Int.J.Legal Med.117(2)：75-81.

Grassberger M,Reiter C,2001.Effect of temperature on Lucilia sericata(Diptera：Calliphoridae)development with special reference to the isomegalen-and isomorphen-diagram.Forensic Science International,120(1-2)：32-36.

Greenberg B,Szyska ML,1984.Immature stages and biology of fifteen speciesof Peruvian calliphoridae(Diptera).Annals of the Entomological Society of America,77(5)：488-517.

Hu C,Min JX,2000.Forensic Entomology.Chongqing：Chongqing Publishing House,165-167.[胡萃,闵建雄.2000.法医昆虫学.重庆：重庆出版社]

Schroeder H,Klotzbach H,Püschel K,2003.Insects'colonization of human corpses in warm and cold season.Legal Medicine,5(Supplement 1)：S372-S374.

Shi YW,Liu XS,Wang HY,Zhang RJ,2008.Summary in thebiology of Chrysomya megacephala(Fabricuis)and application in forensic entomology.Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni,47(z1)：70-76.[时燕薇,刘小山,汪海洋,张润杰,2008.大头金蝇的生物学及其在法医昆虫学上的应用.中山大学学报(自然科学版),47(z1)：70-76]

Wang JF,Li ZG,Yu LC,Chen QS,Huang AH,Liao MQ,Xie YT,Chen YC,2008.Succession and development of insectson pig carcasses and their significances in estimating PMI in the Pearl River Delta region.Acta Entomologica Sinica,51(04)：402-410.[王江峰,李志钢,余里聪,陈强盛,黄安海,廖明庆,谢云铁,陈玉川,2008.珠江三角洲猪尸体上昆虫群落的演替及其对法医学中死亡时间推断的指示意义.昆虫学报,51(04)：402-410]

Wang JF,Hu C,Chen YC,Min JX,Li JT,2002.Effect of temperature over the body-length change of Chrysomyia megacephala(Fabrius).Acta Parasitologica et Medica Entomologica Sinica,9(02)：100-105.[王江峰,胡萃,陈玉川,闵建雄,李俊涛,2002.温度对大头金蝇 Chrysomyia megacephala(Fabricius)幼虫体长变化的影响.寄生虫与医学昆虫学报,9(02)：100-105]

Wang JF,Hu C,Chen YC,Min JX,Hu BJ,Li JT,2001.The activity and oviposition behavior in common four necrophagous fly specie.The Journal of Law and Medicine,8(4)：218-223.[王江峰,胡萃,陈玉川,闵建雄,胡丙杰,李俊涛.2001.四种常见尸食性蝇类活动与产卵习性.法律与医学杂志,8(4)：218-223]

Wang JF,Chen YC,Hu C,Min JX,Li JT,2000.Effect of temperature on the body-length change of Lucilia sericata.Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni,39(S2)：141-145.[王江峰,陈玉川,胡萃,闵建雄,李俊涛.2000.温度对丝光绿蝇 Lucilia sericata幼虫体长变化的影响.中山大学学报(自然科学版),39(S3)：141-145]

Wang Y,Liu M,Sun DH,Ding Y,2003.A study on Sarcosaphagous insects species variety with seasons in Chengdu.Journal of Forensic Medicine,19(02)：86-91.[王晔,刘敏,孙大宏,丁勇.2003.成都市嗜尸昆虫种类季节变化研究.法医学杂志 19(02)：86-91]

Xu BH,Gui LH,Zheng B,Ai YC,2001.Effects of diet on the pupal weight of Lucilia sericata.Journal of Tropical Medicine,1(02)：148-150.[许兵红,桂立辉,郑斌,艾予川,2001.不同饲料对丝光绿蝇蛹重的影响.热带医学杂志,1(02)：148-150]

Xue WQ,Zhao JM,1987.Flies of China.Shenyang：Liaoning Science and Technology Publishing House,256-270.[薜万琦,赵建铭,1987.中国蝇类.沈阳：辽宁科学技术出版社,256-270]

Yang YP,Ren JC,Liu L,Li YW,Yan R,Wang XJ,Zhang XZ,1998.Study on necrophagous mucoid flies living on human corpses in Beijing and its application on forensic medicine practice.Chinese Journal of Forensic Medicine,13(3)：159-162.[杨玉璞,任嘉诚,刘力,李彦文,阎荣,汪兴鉴,张学忠,1998.北京地区尸生性蝇类研究及其在法医鉴定中的应用.中国法医学杂志,13(3)：159-162]