中药蟾酥免疫增强剂对肉仔鸡免疫器官生长发育及免疫活性细胞的影响

李敬双,于 洋,唐雨顺,张玉科,李 明,李 敏,田莉莉

(辽宁医学院畜牧兽医学院,辽宁锦州121001)

为解决目前肉仔鸡免疫效果差、发病率高以及化药免疫增强剂存在毒副作用和残留等问题,我们应用中药蟾酥,依据现代中医中药理论,科学组合,研制开发了中药蟾酥免疫增强剂,在实践应用中取得了较好的效果。为进一步阐明它增强免疫作用的机制,本试验对肉仔鸡饲料中添加中药蟾酥免疫增强剂后,免疫器官的生长发育情况以及免疫器官中T淋巴细胞和浆细胞的变化情况进行了观察,结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物 1日龄AA健康肉仔鸡200羽,购自辽宁医学院实验动物饲养中心。

1.1.2 药物 中药蟾酥免疫增强剂,由本课题组提供。

1.1.3 鸡马立克氏病液氮疫苗(冻克灵Rispens)

冻克灵疫苗系Rispens CVI988株马立克氏病液氮疫苗,由南京梅里亚动物保健有限公司生产。批号：09R0390。

1.1.4 试剂 4%多聚甲醛固定液,副品红溶液,六偶氮副品红溶液,α-醋酸萘酯溶液,反应液,甲基绿染色液,甲基绿-派洛宁染液本实验室配制。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 将1日龄AA健康肉仔鸡200羽随机分为两组,每组100羽,统一饲喂相同质量的全价饲料,1日龄颈部皮下注射冻克灵Rispens,每羽0.2 mL。第一组雏鸡分别于第1周(1～7日龄)和第3周(15～21日龄)于饲料中添加0.5%中药蟾酥免疫增强剂。第二组雏鸡作为空白对照。其余管理措施两组完全一致。

1.2.2 免疫器官生长发育情况的测定 两组雏鸡分别于14日龄和28日龄,各随机抽取发育正常的20羽个体,空腹称重,按常规方法屠宰,分离胸腺、腔上囊和脾脏,用滤纸吸去表面水分后,电子天平称量湿重。指数测定,脏器指数 =免疫器官重量(mg)/体重(g)×100%。

1.2.3 免疫器官中T淋巴细胞和浆细胞数的检测 免疫器官中T淋巴细胞数的检测 两组雏鸡分别于14日龄和28日龄无菌采样,各随机采取20羽雏鸡胸腺、腔上囊和脾脏的特定部位,固定于4%多聚甲醛,丙酮脱水,石蜡切片,分别进行α-醋酸萘酯酶法(ANAE)染色和甲基绿-派洛宁细胞化学染色法(PMG)染色,油镜观察相应区域单位面积(10 mm2)中T淋巴细胞和浆细胞的数量[1]。

1.3 数据处理 数据间差异的显著性采用SPSS 13.0软件中的t检验,比较处理组与空白对照组的差异显著性。

2 结果

2.1 中药蟾酥免疫增强剂对免疫器官生长发育的影响

2.1.1 对胸腺生长发育的影响 在14日龄和28日龄添加中药蟾酥免疫增强剂组试验肉仔鸡胸腺的重量和指数均高于空白对照组,其中在14日龄时重量和指数均差异显著,(P＜0.05)。在28日龄时重量差异显著(P＜0.05),见表1。

2.1.2 对腔上囊生长发育的影响 在14日龄和28日龄,添加中药蟾酥免疫增强剂组试验肉仔鸡腔上囊的重量和指数高于空白对照组,其中在14日龄时重量和指数均差异显著(P＜0.05),在28日龄时重量差异显著(P＜0.05),见表1。

2.1.3 对脾脏生长发育的影响 在14日龄和28日龄添加中药蟾酥免疫增强剂组试验肉仔鸡脾脏的重量与指数均高于空白对照组,其中在14日龄时重量和指数均差异显著(P＜0.05),在28日龄时重量差异显著(P＜0.05),见表1。

2.2 中药蟾酥免疫增强剂对免疫器官中免疫活性细胞的的影响14日龄和28日龄,添加中药蟾酥免疫增强剂组试验肉仔鸡胸腺中 T淋巴细胞和浆细胞的数量均明显高于空白对照组,其中中药蟾酥免疫增强剂组在14日龄时胸腺皮质和髓质中的T淋巴细胞数、髓质中的浆细胞数和对照差异显著(P＜0.05),结果见表2。

2.2.2 对腔上囊中T淋巴细胞和浆细胞数的影响在14日龄和28日龄,添加中药蟾酥免疫增强剂组试验肉仔鸡腔上囊淋巴滤泡中T淋巴细胞和浆细胞的数量均明显高于空白对照组,其中中药蟾酥免疫增强剂组在14日龄和28日龄腔上囊淋巴滤泡皮质和髓质中的浆细胞均和对照组差异显著(P＜0.05),在28日龄皮质中的淋巴细胞数和对照组差异显著(P＜0.05),结果见表2。

2.2.3 对脾脏中T淋巴细胞和浆细胞数的影响在14日龄和28日龄,添加中药蟾酥免疫增强剂组试验肉仔鸡脾脏中T淋巴细胞和浆细胞的数量均明显高于空白对照组,其中在14日龄时脾脏红髓中的浆细胞数和动脉周围淋巴鞘中的 T淋巴细胞数和对照组比较差异显著(P＜0.05)。在 28日龄时动脉周围鞘中的浆细胞数和T淋巴细胞数,红髓中的浆细胞数和对照组差异显著(P＜0.05)。结果见表2。

表1 中药蟾酥免疫增强剂对免疫器官生长发育的影响

表2 中药蟾酥免疫增强剂对免疫器官中T淋巴细胞和浆细胞数的影响

3 讨论

3.1 在本试验中,添加中药蟾酥免疫增强剂组雏鸡胸腺、腔上囊和脾脏等免疫器官的重量和指数均明显高于空白对照组,其中在14日龄时两组间3大免疫器官和重量及胸腺和脾脏的指数均差异显著(P＜0.05)。在28日龄时两组间3大免疫器官的重量及腔上囊的指数差异显著(P＜0.05)。免疫器官重量的增加是生长发育快的表现,而指数的提高意味着免疫系统成熟较快[2],说明在正常饲料中添加中药蟾酥免疫增强剂,可促进肉仔鸡免疫器官的生长发育和迅速成熟,从而使肉仔鸡整体免疫机能加强,抵抗各种病原微生物感染和抗各种应激的能力得到提高。

3.2 在本试验中,添加中药蟾酥免疫增强剂组肉仔鸡胸腺、腔上囊和脾脏中的T淋巴细胞和浆细胞数均明显高于空白对照组,其中在14日龄时,免疫增强剂组胸腺皮质和髓质中的T淋巴细胞数、脾脏动脉周围鞘的T淋巴细胞数和空白对照组差异显著(P＜0.05);腔上囊皮质和髓质的浆细胞数、胸腺髓质和脾脏红髓的浆细胞数和空白对照组差异显著(P＜0.05)。在28日龄时,免疫增强剂组胸腺髓质,腔上囊皮质及脾脏动脉周围鞘T淋巴细胞和对照组差异显著(P＜0.05);腔上囊皮质和髓质的浆细胞数及脾脏红髓和动脉周围鞘中的细胞数和对照组差异显著(P＜0.05)。本试验所用中药蟾酥免疫增强剂可明显促进免疫器官中免疫活性细胞的增殖,提高机体细胞免疫和体液免疫的机能[3-4]。

3.3 通过应用整体或离体的试验方法和不同核细胞、淋巴细胞及其亚群、自身抗体、细胞因子等多方面的指标,从不同的侧面揭示了蟾酥及其有效成分对免疫系统的保护作用。通过溶血空斑形成细胞(PFC)试验,E-花环形成细胞(ERFC)试验,聚集IgG抑制ERFC恢复试验以及单核、巨噬功能试验,发现蟾酥制剂可增高小鼠脾脏抗体形成细胞活性率,激活小鼠腹腔游走巨噬细胞,提高其吞噬细菌和抑制细菌的能力[5],也能稳定提高放射线照射治疗后下降的白细胞数量[6];日本研究人员,从生药蟾酥水溶性非透析部分中发现了促淋巴细胞增殖物质,该部分过Con A-琼脂糖亲和色谱柱后,作用明显增强,经分析得知,其有效成分之一为含 D-甘露糖、分子量约13 k Da的糖蛋白,纯化后能提高脾细胞培养上清液中IL-2和IL-12的水平,增强C3H/HeN小鼠脾淋巴细胞的天然杀伤力[7];蟾酥水溶性总成分能增强网状内皮系统吞噬功能,提高机体非特异性免疫作用[8-9];华蟾素制剂能显著增加环磷酰胺(CTX)所致的免疫抑制状态下的小鼠血清中的IgG含量,显著增加CTX所致白细胞减少症的小鼠外周血白细胞数,提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数,表明华蟾素对细胞免疫,体液免疫和非特异性免疫均有促进作用;华蟾素注射液还可以诱导外周血单核细胞产生IL-2,增加LAK细胞的杀伤活性,可见华蟾素制剂的免疫增强作用也是其抗肿瘤作用机理之一[10]。

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