抗HIV-1gp120单克隆抗体的制备及鉴定

张永臣,文 剑,张 亮,赵 磊

(东南大学 附属第二医院 检验科,江苏 南京 210003)

艾滋病(AIDS)自1981年美国首次发现以来,在全世界迅速蔓延[1-3],对人类健康造成了极大威胁。全球流行的人类免疫缺陷病毒(HIV)根据血清反应和病毒核酸序列可分为2型:HIV-1型和HIV-2型[4]。HIV-1型广泛分布于世界各地,是引起全球AIDS流行的主要病原,所以目前HIV的研究主要集中在HIV-1型。HIV-1型的包膜糖蛋白(env)基因编码gp160蛋白,进一步加工成gp120及gp41,具有较强的抗原性[5]。迄今为止,人类尚没有治疗或预防AIDS的特效药物或疫苗,但研究证明抗体具有阻断病毒入侵、中和病毒活性和抑制病毒复制的作用,为AIDS的治疗带来了希望。本文通过制备、鉴定抗HIV-1 gp120单克隆抗体,为进一步研制抗HIV治疗性抗体奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 BALB/c小鼠购自上海斯莱克生物实验动物中心;SP2/0小鼠骨髓瘤细胞系由本实验室保存。

1.1.2 HIV-1 gp120基因片段 由卫生部抗体技术重点实验室朱进博士提供。基因序列为:5′-GATCCGGTGAACTGGACAAATGGGCAGGCCCGGGTCGTGCA TT CTACGAGCTGGATAAGTGGGCTGGTCCGGGCCGCG CTTTCTACA-3′和5′-TCGAGTGTAGAAAGCGCGGCCC GGACCAGCCCACTTATCCAGCTCGTAGAATGCACGACC CGGGCCTGCCCATTTGTCCAGTTCACC-3′。HIV-1 gp120抗原、HIV抗原硝酸纤维膜条由北京万泰药业公司提供。

1.1.3 主要试剂及工具酶类 Bam HⅠ内切酶XhoⅠ内切酶、核酸共沉淀剂、T4 DNA Ligase购自宝生物有限公司;Liagen胶回收试剂盒购自QIAquick公司;RPMI 1640干粉培养基购自Gibco公司;优级新生牛血清购自明海生物工程有限公司;Supersignal West Pico Trial Kit、TMB Substrate Kit购自 Pierce 公司;小鼠Ig亚类检测试剂盒、福氏佐剂及PEG、Hypoxanthine、Thymidine和Aminoptem购自Sigma公司。HIV-抗体诊断试剂盒购自上海科华生物有限公司,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自博士德有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒构建及鉴定载体质粒PEGX-4T-2用Bam HⅠ、XhoⅠ酶切,T4DNA Ligase连接 gp120基因片段,重组质粒转化入大肠杆菌XL1-blue,送南京金思特科技有限公司测序。

1.2.2 重组蛋白的诱导表达及鉴定重组质粒转化入XL1-Blue大肠杆菌中,在IPTG诱导剂作用下25℃,190 r/min震荡,过夜。4 000 r/min离心10 min,收集细菌。SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。

1.2.3 融合蛋白纯化和鉴定表达产物离心收集沉淀经PBS悬起,用30 W超声粉碎仪裂解细菌后,将其离心收集上清过滤。滤液用AKTA PURIFYER 100蛋白纯化仪、GST柱纯化,得到融合蛋白GSTHIV,浓缩离心管进行浓缩,S21型生物分光光度计测量浓度。SDS-PAGE对纯化蛋白进行鉴定。

1.2.4 动物免疫 BALB/c小鼠,6周龄,雌性,4只。第1次免疫加弗氏完全佐剂,100μg/只,腹腔注射。第2,3次免疫加弗氏不完全佐剂,腹腔注射。ELISA检测血清效价达10-4时,加强免疫1次,200 μg/只,腹腔注射。3 d后进行细胞融合。

1.2.5 杂交瘤细胞株的建立 小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以1∶5在50%PEG作用下融合。用HAT筛选杂交瘤细胞,间接ELISA筛选阳性克隆,有限稀释法进行克隆化培养建株。经体外传代培养及液氮冻存复苏后,仍能稳定分泌特异性抗体者表示建株成功。

1.2.6 单克隆抗体腹水的制备 10周龄BALB/c小鼠12只,每只小鼠腹腔注射降植烷0.3mL,1周后,腹腔注射6×105个/鼠杂交瘤细胞。8 d后,采集腹水,2 000 r/min离心10 min,去除油脂沉淀,吸取上清,-70℃保存。

1.2.7 单克隆抗体特性鉴定

1.2.7.1 Ig亚类鉴定和效价测定腹水用过滤离心法纯化后,采用ELISA检测试剂盒,按说明书操作,测定单抗的Ig亚类。腹水以常规ELISA法测定单抗效价。

1.2.7.2 Western blot检测 HIV-1 gp120蛋白100℃,5 min做变性处理,制备电泳凝胶,进行SDSPAGE。将蛋白在300 mA,60 min,转到硝酸纤维素薄膜上。5%脱脂牛奶封闭2 h,杂交瘤细胞培养上清为一抗,作用时间1 h,HRP标记羊抗鼠IgG为二抗,作用时间1 h,显色后曝光。

1.2.7.3 重组免疫印迹分析(RIBA) 将HIV抗原硝酸纤维膜条放入槽中,将制备的单抗以1∶10稀释后加入槽内,37℃孵育1 h,洗涤3次,将HRP标记羊抗鼠IgG加入槽内37℃孵育1 h,洗涤3次,TMB显色15 min,硫酸终止。检测单抗与gp120,gp41,gp24,gp36,gp66,gp51,gp17是否反应。

2 结 果

2.1 重组质粒的构建和鉴定

将HIV-1 gp120基因片段插入到经Bam HⅠ、XhoⅠ酶切处理后的PEGX-4T-2载体中,获得PEGX-4T-2-HIV重组质粒。重组质粒经测序,结果与预期一致。

2.2 重组蛋白的表达、纯化及鉴定

通过SDS-PAGE检测,在相对分子质量(Mr)32 000左右有1条浓度很高的条带,可以推测为HIV-1 gp120融合蛋白(见图1)。分光光度法测得浓度为3.65mg/mL。

2.3 杂交瘤细胞株的建立

融合后获4个阳性克隆,挑选2株吸光度值较高的阳性克隆进行亚克隆。经2次亚克隆后获得6株能稳定分泌抗体的细胞,分别命名为4H1-A5-F3、4H1-1B6-G10、4H1-2B6-C2、4H1-2B6-G8、4HI-2B6-C5和4H1-E6-G9。经体外传代培养及液氮冻存复苏后,仍能稳定分泌特异性抗体。

2.4 单克隆抗体特性鉴定

经Ig亚类ELISA试剂盒测定,杂交瘤细胞培养上清及腹水中的抗体均为IgG1,细胞培养上清效价为2×10-3,腹水效价为5×10-5。

6株单克隆抗体皆只与gp120抗原反应,与gp41、gp24、gp36、gp66、gp51、gp17 无交叉反应 。

Western blot分析结果表明,在Mr32 000左右可见1条明显单一目的条带。6株结果相同,列出其中2株细胞的条带(图2)。

3 讨 论

AIDS是由HIV引起的一种致命性慢性传染病。HIV侵犯和破坏辅助性T淋巴细胞,使机体的细胞免疫功能受损,最后可并发严重的机会性感染和肿瘤。该病传播快、病死率高,且目前无法治愈。在对抗艾滋病的过程中,gp120和gp41是HIV的主要抗原,能诱导机体产生针对HIV的中和抗体。HIV侵入人体后虽能刺激机体产生抗体,但中和抗体很少,故难以抑制HIV的繁殖。

HIV中gp120/gp41蛋白分布在细胞膜表面,gp120介导HIV与CD4+T细胞结合,被HIV-1感染的细胞能通过其表面的gp120与其它未被感染的CD4+T细胞发生“细胞融合现象”。因此,以gp120为靶点的抗体可以抑制病毒进入细胞形成合胞体[6]。近年来,以gp120为靶点的单克隆抗体药物也就成为研究的热点[7]。Lewis等[8]证明人MAb IgG 1b12能识别gp120与CD4结合位点重叠的序列,在体外实验中能中和HIV-1感染。

本实验通过构建重组质粒,制备、纯化HIV-1 gp120重组蛋白,获得6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结果表明,6株单抗皆可与HIV-1 gp120抗原特异性结合,与gp41、gp24、gp36 、gp66、gp51、gp17无交叉反应。提示本文制备的抗HIV-1 gp120单抗具有较好的特异性。实验中表达的融合蛋白Mr为32 000,而目的蛋白gp120的Mr只有6 000。用其免疫小鼠,小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后铺10块96孔ELISA板,获得4株阳性克隆。这种用融合蛋白免疫小鼠制备单抗,只有尽可能多铺板,且融合率要很高时,才有可能获得需要的目的抗体。本实验使用朱进博士提供的HIV-1 gp120基因片段,该片段是HIV-1 gp120基因的一段恒定区域,避免了全段基因制备的针对可变异区域的抗体的产生。

通过对抗HIV-1中和抗体的研究,发现要想预防或者控制HIV-1的感染,可能需要多种针对不同表位的中和抗体的协同作用,而且最理想的是以Env为靶点的多种中和抗体的联合应用。Frankel等[9]联合应用单抗 IgG1b12、2F5和2G12,可防止病毒进入人树突状细胞,进一步控制HIV-1的感染。本实验制备的6株抗HIV-1 gp120单克隆抗体,目前正在进行对HIV抑制作用的研究,将为进一步研制抗HIV治疗性抗体奠定基础。

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