黄粉虫幼虫降血压肽酶解液脱色工艺的优化

代春华，马海乐，赵圣惠，顾小红，汤 坚，*

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.江南大学食品科学与安全教育部重点实验室，江苏无锡214122）

黄粉虫幼虫降血压肽酶解液脱色工艺的优化

代春华1，2，马海乐1，赵圣惠1，顾小红2，汤 坚2，*

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.江南大学食品科学与安全教育部重点实验室，江苏无锡214122）

采用粉末活性炭对脱脂黄粉虫幼虫降血压肽酶解液进行脱色处理。通过单因素和正交实验，考察了活性炭用量、pH、温度和吸附时间等因素对脱色率（DE）、肽损失率（LP）和溶液对血管紧张素酶（ACE）的活性抑制率（IP）的影响。结果表明，粉末活性炭用量3%，pH3，脱色温度40℃，吸附时间50min的条件下，黄粉虫幼虫降血压肽酶解液脱色效果明显，脱色率为85.3%，ACE抑制活性为70.8%。

黄粉虫幼虫，降血压肽，酶解液，脱色

黄粉虫学名：Tenebrio molitor Linne，别名大黄粉虫、黄粉甲，俗称面包虫，是一种大型的仓储害虫。黄粉虫幼虫中脂肪、蛋白质含量高，素有“动物蛋白饲料之王”的称誉。长期以来，由于对其缺乏系统的研究，因此开发利用较少，使大量的营养资源被浪费［1-3］。为更好地开发利用此资源，作者以脱脂黄粉虫幼虫为原料进行酶解制备降血压肽，实验结果表明酶解液具有较好的降血压效果，但黄粉虫幼虫在酶解过程中会伴随大量色素物质生成，导致酶解液为棕黄色，影响后续的分离纯化效果。因此，本研究采用生产中常用的粉末活性炭进行脱色处理。以脱脂黄粉虫幼虫酶解液为原料，以脱色率（DE）和肽损失率（LP）为指标，采用单因素实验对粉末活性炭脱色工艺条件进行比较，在肽损失率达到要求的基础上，再以脱色率和酶解液对血管紧张素酶（ACE）的活性抑制率（IP）为指标，通过正交实验考察各因素对指标的影响，确定黄粉虫幼虫酶解液脱色的最优工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄粉虫幼虫粉 由镇江市丹徒区恒哲生态养殖场提供，均为干燥并粉碎的样品，水分10%，油脂30.8%，蛋白质 42.6%［4］；Alcalase蛋白酶 丹麦NovoNordisk公司提供；FAPGG、羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） Sigma公司；其他化学试剂 上海国药集团。

756 MC型紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；TGL-16高速台式冷冻离心机 长沙湘仪仪器有限公司；HH-S数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂；pHS-3TC数显pH计 上海天达仪器有限公司；电子天平 北京赛多利斯系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄粉虫幼虫降血压肽酶解液的制备 称取5g黄粉虫幼虫粉装入滤纸筒中，于索氏抽提器中以无水乙醚为提取剂回流提取4h，水浴温度55℃。脱脂样品于干燥箱中65℃干燥至恒重。

称取3g脱脂黄粉虫幼虫粉，加入70mL蒸馏水，置50℃水浴中，加入40μL碱性蛋白酶（酶活力为34万个单位），酶解1.5h，置沸水浴中15min使酶失活。离心、过滤、定容至100mL备用。

1.2.2 活性炭吸附脱色实验 向脱脂黄粉虫幼虫酶解液中加入一定量的吸附剂，在一定的温度、pH条件下吸附一定时间，高速离心后过滤得上清液，测其脱色率、肽损失率及溶液对ACE抑制活性。

1.2.3 脱色率和肽损失率测定 用紫外分光光度计在色素的最大吸收波长处（400nm）和蛋白质的最大吸收波长处（280nm）分别测定溶液的吸光值，计算溶液脱色率（DE）和肽损失率（LP）［5-6］。

DE=（OD400-OD′400）/OD400×100%

其中：OD400为脱色前光吸收度；OD′400为脱色后光吸收度。

LP=（OD280-OD′280）/OD280×100%

其中：OD280为脱色前光吸收度；OD′280为脱色后光吸收度。

1.2.4 ACE抑制活性（IP）的测定 将样品溶液稀释20倍后，以FAPGG（FA-Phe-Gly-Gly）作为ACE的底物，测定各组分的ACE抑制活性［7］。测定在酶标仪中进行，按表1所示进行测定。

表1 ACE抑制活性的测定

加样完成后立即在340nm测定对照孔和样品孔的初始吸光度，分别设为a1和b1，在37℃的环境中避光放置30min后再次测定在340nm的吸光度，分别设为a2和b2。对照孔的吸光度减少A=（a1-a2），样品孔的吸光度减少B=（b1-b2），抑制率（%）=（A-B）/A×100%

ACE酶活单位定义：在 37℃、1min内催化FAPGG形成1μmol的FAP（FA-Phe）所需的酶量。

1.2.5 正交实验 为获得脱色效果较好的脱脂黄粉虫幼虫酶解液，在单因素实验基础上，通过L9（34）正交实验确定最佳脱色条件，以脱色率及ACE抑制活性为指标，各因素和水平的选择见表2。

表2 正交实验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 活性炭用量对脱色率和肽损失率的影响

将脱脂黄粉虫幼虫酶解液的pH调至4，分别加入不同量的活性炭，在40℃下脱色40min，不同活性炭用量对酶解液脱色率和肽损失率的影响结果见图1。由图1可知，随着活性炭用量的增加，脱色率提高，但肽损失率也随之增加，综合考虑在脱色效果已达到要求的范围内，应以肽损失率最小为目标，因为随着肽损失率的增加有可能使溶液中的活性成分也损失掉，故活性炭用量在3%较为适宜。

图1 活性炭用量对脱色率和肽损失率的影响

2.2 pH对脱色率和肽损失率的影响

向酶解液中加入3%的活性炭，脱色温度为40℃，分别在不同pH下脱色40min，pH对脱色率和肽损失率的影响结果如图2所示。由图2可知，pH对脱色率及肽损失率的影响非常明显，活性炭在pH小于4的酸性范围内脱色效果明显好，但肽的损失率也较大。综合考虑脱色率和肽损失率两个方面的因素，应该在脱色效果已达到要求的范围内，选择肽损失率较低的pH，故确定溶液脱色pH为4。

图2 pH对脱色率和肽损失率的影响

2.3 脱色温度对脱色率和肽损失率的影响

将酶解液pH调至4，加入3%的活性炭，分别在不同的温度下脱色40min，温度对酶解液DE和LP影响结果如图3所示。由图3可知，随着温度的升高，脱色率提高，同时肽损失率也增加，综合考虑脱色效果和肽损失率两个因素，选择脱色温度50℃。

图3 温度对脱色率和肽损失率的影响

2.4 吸附时间对脱色率和肽损失率的影响

将酶解液pH调至4，加入3%的活性炭，于50℃分别脱色20、40、60、80、100min，酶解液脱色率和肽损失率的变化结果如图4所示。从图4可知看出，脱色时间为40min时，活性炭对酶解液的脱色率最高，随后逐渐降低；肽损失率也在脱色时间为40min时达到最大值，随着脱色时间增加，肽损失率也在不断地下降。在肽损失率较低的情况下，选择脱色效果较好的时间条件，因此，脱色时间以40min为宜。

图4 吸附时间对脱色率和肽损失率的影响

2.5 正交实验结果分析

由于上述单因素实验中未曾考虑因素之间的交互影响，因此，在以上实验基础上对上述四个因素进行正交实验，由于脱脂黄粉虫幼虫酶解液中所含的活性肽有可能被活性炭吸附，在上述单因素实验中用肽损失率还不能很好地反映出溶液中活性部分的保留情况。因此，正交实验则改用酶解液的脱色率和ACE的抑制活性为考察指标，以确定最佳脱色条件，正交实验结果如表3所示。

表3 正交实验设计及结果

由表3可以看出，四个影响因素对脱色率和对ACE抑制活性的影响是不同的，活性炭在酶解液脱色的过程中，要求脱色率和溶液活性最大，本研究采用加权评分法，确定两者的权重系数均为0.5后对两项指标进行加权求和得到综合评分如表4［6］。

表4 加权综合评分结果

从加权综合评分结果看出，溶液的pH对脱色率及ACE抑制活性的影响最为明显，其次是活性炭用量，脱色温度对指标的影响最小，最佳脱色条件为：A2B1C1D2，在此条件下进行脱色实验，测得脱色率为85.3%，ACE抑制活性为70.8%。

3 结论

脱脂黄粉虫幼虫酶解液颜色较深，对其进一步分离纯化产生不良影响，因此必须对酶解液进行脱色。以脱色率及肽损失率为指标，通过单因素实验筛选出活性炭对酶解液脱色的较佳条件。再以脱色率和对ACE抑制活性为指标进行正交实验，得出脱色最佳条件为：粉末活性炭用量3%，pH3，脱色温度40℃，吸附时间50min。在此实验条件下，测得酶解液的脱色率为85.3%，ACE抑制活性为70.8%。黄粉虫幼虫降血压肽酶解液为透明浅黄色，可直接进行后续分离纯化工作。

［1］王文亮，孙守义，王守经，等.中国黄粉虫食品研究开发现状及发展前景［J］.世界农业，2007（9）：50-52.

［2］赵大军.黄粉虫的营养成分及食用价值［J］.粮油食品科技，2000，8（2）：41-42.

［3］杨兆芬，林跃鑫，陈寅山，等.黄粉虫幼虫营养成分分析和保健功能的实验研究［J］.昆虫知识，1999，36（2）：97-101.

［4］代春华，马海乐，顾小红，等.黄粉虫幼虫及蛹中营养成分分析［J］.食品工业科技，2009（4）：315-317.

［5］周利亘，王君虹，陈新峰，等.大豆蛋白酶解液脱色工艺的优化［J］.浙江农业学报，2005，17（3）：130-133.

［6］廖丹葵，万顺刚，黄爱民，等.蛋黄降压肽酶解液脱色工艺的优化［J］.食品工业科技，2007，28（1）：151-153.

［7］毕昊，刘志国，屈伸，等.米糠蛋白酶解产物中血管紧张素转化酶抑制剂的研究［J］.华中科技大学学报：医学版，2005，34（6）：699-706.

Optimization of decolouring technology of antihypertensive peptides hydrolysate from defatted larva of Tenebrio molitor（L.）

DAI Chun-hua1，2，MA Hai-le1，ZHAO Sheng-hui1，GU Xiao-hong2，TANG Jian2，*
（1.School of Food and Biology Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Single factor and orthogonal experiments were applied to investigate the optimum conditions of decolouring of defatted larva of Tenebrio molito（rL.）hydrolysate.ln the experiments，the factors of activated carbon quantity，pH，temperature and absorption time were considered in terms of decolouring efficiency，peptide loss and inhibition percentage of angiotensin converting enzyme（ACE）activity.The results showed that optimum decoloration effect was obtained from the following conditions：quantity of activated carbon 3%，pH value 3，temperature 40℃，and adsorption time 50min，respectively.Then decolouring efficiency and inhibition percentage of ACE were 85.3%and 70.8%，respectively.

larva of Tenebrio molito（rL.）；antihypertensive peptides；hydrolysate；decolorization

TS201.1

B

1002-0306（2010）12-0261-03

2009-12-28 *通讯联系人

代春华（1972-），女，讲师，在读博士，主要从事食品功能性因子的检测。

镇江市农业科技项目（NY2008028）。