维吾尔族血糖异常人群肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱分析

张雪雁 李琳琳

维吾尔族血糖异常人群肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱分析

张雪雁 李琳琳

目的:应用ERIC-PCR指纹图谱技术，以新疆地区维吾尔族人群肠道菌群为研究对象，初步探讨血糖不同人群的肠道菌群结构特征以及与2型糖尿病的关系。方法:以不同血糖人群的粪便为样本，直接提取细菌总DNA，以此为模板进行ERIC-PCR扩增，得到反映肠道菌群结构特征的DNA指纹图谱，并进行比较分析。结果:正常空腹血糖人群的肠道菌群结构有一定差异，但它们却有着共同的结构特征；正常空腹血糖人群与2型糖尿病人群和糖耐量减低人群间的肠道菌群结构差异较大。结论:通过分析比较指纹图谱的差异，提示维吾尔族人群的肠道菌群结构很有可能与2型糖尿病有一定的关系。

2型糖尿病；菌群结构；ERIC-PCR；DNA指纹图谱

人类肠道定植着一个十分复杂而又相对稳定的微生物区系，这个区系栖息的细菌大约有400多种，数量达1014左右［1］，形成一个极其复杂的微生态系统。这些固有的肠道细菌含有种类繁多的酶系统，参与宿主能量、物质及遗传信息转运等一系列生理过程[2－4]。

通过对新疆部分地区2型糖尿病进行流行病学调查研究，结果显示:新疆维吾尔族2型糖尿病的患病率较高，约为14%。医学研究表明，在高蛋白多肉食与高纤维饮食地区生活的人群相比较，两种人群的粪便中细菌种类与数量有显著的区别。基于维吾尔族的饮食结构特点及生活环境特点，提示其肠道菌群的种类与数量具有一定的特征，这可能与2型糖尿病的发生有关。

本文以维吾尔族正常空腹血糖组人群、糖耐量减低组人群和2型糖尿病人群为研究对象，直接从粪便中提取细菌总基因组DNA，用ERIC-PCR指纹图谱技术，对肠道菌群的结构特征进行分析，比较三组人群的肠道菌群的种类数量和种群的差异，以求找到肠道内与健康及2型糖尿病有重要关系的菌群及结构特点，初步探讨维吾尔族2型糖尿病患病率较高的原因，寻找最佳的治疗方案。

1 材料

1.1 样品收集 根据WHO公布的糖尿病诊断标准，筛选了40例正常空腹血糖者和11例2型糖尿病患者。所用粪便样品收集后立即在－20℃冷冻保存备用。

1.2 试剂 裂解液I:NaCl、Na2EDTA，pH8.0；裂解液II:NaCl、Tris-HCl，pH8.0。SDS、RNA酶、溶菌酶、蛋白酶K、Taq酶等均购自上海生工生物工程公司。

2 方法

2.1 样品前处理 称取1g样品，用无菌PBS溶液涡旋混匀后低速离心，收集上清。重复三次。然后5000r/min离心上清，收集沉淀后－20℃保存备用。

2.2 细菌总DNA的提取 取处理好的样品，依次加入裂解液I和溶菌酶，轻轻混匀10min后，冰浴70min；加入裂解液II、10%SDS，轻轻混匀加入蛋白酶K，混匀10min后37℃水浴过夜；分别加入等体积Tris-HCl饱和酚、饱和酚和氯仿异戊醇、氯仿抽提；加入无水乙醇沉淀过夜后，高速离心30min留沉淀，干燥后溶于TE中，加入RNA酶37℃水浴消化后－20℃冷冻备用。

2.3 ERIC－PCR 参照文献[9]，利用引物ERIC-1和ERIC-2进行扩增，反应条件:95℃预变性7min、经30个循环（94℃1min、52℃1min、65℃8min），最后65℃延伸16min。

2.4 检测 取扩增产物8μl经1%琼脂糖凝胶电泳后，进行检测。

2.5 指纹图谱分析 采用SPSS统计软件进行统计分析。

3 结果

3.1 正常空腹血糖组人群的ERICPCR电泳检测结果

图1 和图2显示，不同个体的ERICPCR指纹图谱虽存在有差异，但它们在800bp～900bp、1200bp～1500bp之间有明亮整齐的条带存在。

图1 正常空腹血糖组人群ERIC-PCR电泳检测结果

图2 正常空腹血糖组人群ERIC-PCR电泳检测结果

3.2 正常空腹血糖组、糖耐量减低组和2型糖尿病组人群间肠道菌群结构的差异

3.2.1 三组人群ERIC-PCR电泳检测结果

图3 和图4显示，正常空腹血糖组人群的ERIC-PCR指纹图谱在800bp～900bp、1200bp～1500bp之间有较明亮整齐的条带存在，而2型糖尿病组和糖耐量减低组则条带亮度弱或无条带存在。

图3 正常空腹血糖组人群和2型糖尿病组人群的ERIC-PCR电泳检测结果

图4 2型糖尿病组人群和糖耐量减低组的ERIC-PCR电泳检测结果

3.2.2 三组人群的ERIC-PCR指纹图谱在800～900bp、1200～1500bp条带检出率

表1、2显示，正常空腹血糖组与糖耐量减低组(IGT)、2型糖尿病组(T2DM)之间具有显著性差异。

4 讨论

E R I C是肠杆菌基因间重复共有序列，具有一定的保守性，定位在基因组中可转录的非编码区或与转录有关的区域内[5]。由于ERIC重复序列分布的位置及拷贝数在不同细菌中均不相同，通过扩增，这种差异可以反映在ERIC-PCR指纹图谱中[6-9]。本文利用ERIC-PCR电泳指纹图谱技术对维吾尔族正常空腹血糖组、IGT组和T2DM组人群间肠道菌群结构特征进行比较和分析。实验结果显示，40例正常空腹血糖组人群中，在800bp～900bp、1200bp～1500bp之间有明亮整齐的条带存在的检出率分别为72.50%、67.50%；14例IGT和T2DM组人群中，检出率分别为21.43%、14.29%。由此可以推断在正常空腹血糖组人群中普遍存在的800bp～900bp、1200bp～1500bp之间的DNA片段所代表的细菌很可能与血糖有关。IGT和T2DM组人群的肠道菌群在800bp～900bp、1200bp～1500bp之间的条带信号缺失或很弱，说明IGT和T2DM组人群的肠道菌群失衡，发生血糖升高很有可能与这些DNA片段所代表的细菌缺失有关。

根据ERIC-PCR指纹图谱提供的线索，很有希望找到一些与血糖相关的DNA片段，然后将这些DNA片段克隆测序，找到来源的细菌，看是否可以通过调整肠道菌群，找到维吾尔族2型糖尿病患病率水平高的原因，为寻找最佳的治疗方案提供依据，这对于2型糖尿病的防治展示了较美好的前景。

表1 三组人群在800～900bp条带检出率

表2 三组人群在1200～1500bp条带检出率

[1] 田洪涛，张柏林，贾英民，等.双歧杆菌与人体胃肠道微生态［J］.河北农业大学学报.

[2] 陆德源土编.医学微生物学[M].人民卫生出版社.

[3] 郭本恒.人肠道菌群的生理功能[J].中国乳品工业.

[4] 康白.微生态学原理.大连出版社.

[5] Hulton,C.S.,C.F.Higgins,er al.ERIC sequences∶a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria[J].Mol Microbiol.

[6] 乔德才，陈敬，魏桂芳，等.采用PCR指纹图谱技术分析中长跑运动员肠道菌群结构特征.中国运动医学杂志.

[7] 乔德才，刘瑾彦，陈敬，等.中长跑运动员胃肠菌群区系结构分布特征的微生态研究.中国运动医学杂志.

[8] 鲁海峰，魏桂芳，李仲逵，等.ERIC-PCR分子杂交技术分析大熊猫肠道菌群结构.中国微生态学杂志.

[9] 张美玲，魏桂芳，郭美蕻，等.健康儿童与发育不佳儿童肠道菌群结构的比较研究.中国微生态学杂志.

10.3969/j.issn.1001-8972.2010.11.098