二苯羟乙酸糖酯酶促合成研究*

王宗君，胡文祥，张良军

（1.广西工业职业技术学院，广西 南宁 530001；2.军事医学科学院，北京 100850）

二苯羟乙酸糖酯酶促合成研究*

王宗君1，胡文祥2，张良军1

（1.广西工业职业技术学院，广西 南宁 530001；2.军事医学科学院，北京 100850）

二苯羟乙酸衍生物及糖类化合物分别具有重要的生理功能，二苯羟乙酸糖酯有可能同样具有一定的生理价值。着重对这类化合物的酶促合成进行探讨，选择定位合成二苯羟乙酸糖酯，收率达26%。

二苯羟乙酸糖酯；酶促合成；选择定位

二苯羟乙酸酯类化合物多数具有重要的生理功能，其在军事和民用上的重要运用已得到广泛认同。例如，美国研究的抗胆碱能药物二苯羟乙酸-3-奎宁酯（QNB）具有很强的拟精神作用，曾用作新型化学战剂—失能剂，二苯羟乙酸-2-（二乙胺基）-乙酯的盐酸盐（Bewactyzine）是治疗胃绞痛良药之一[1]。糖类与多羟基环已烷类衍生物1，4-顺-二羟基（一个α键，一个ε键）两氧相距0.455 nm，与烟碱中两个氧相距0.45 nm接近，这是该类化合物具有抗N样胆碱作用的结构基础[2]，二苯羟乙酸与糖类化合物形成的糖酯有可能同样具有一定的生理价值，为此，本文旨在探讨二苯羟乙酸糖酯的合成。传统的糖酯合成方法，一般都需要反复地保护羟基、糖苷化、脱保护等操作，合成步骤多，路线长，分离和提纯十分繁琐和困难，近10年，酶促合成（Enzyrnatic Synthesis）糖酯是无保护基糖酯合成最有前途方法之一[3-4]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：红外光谱 [FT-IR-408，KBr涂片]，1H-NMR[JNM-GX400，（CD3）2CO 作溶剂]，质谱[MAT-711 型]。

试剂：葡萄糖、D-果糖、乳糖为分析纯试剂，其余为化学纯试剂，水为蒸馏水，脂肪酶（中国科学院上海生物化学研究所，酶比活力＞3 000 U/g），二苯羟乙酸三氯乙醇酯（军事医学科学院）。

1.2 二苯羟乙酸甲酯的合成

二苯羟乙酸甲酯合成反应式：

将11.412g（0.05 mol）二苯羟乙酸，89 mL无水甲醇，置于250 mL三口烧瓶中，搅拌加热至45℃，开始滴加浓H2SO4，回流8 h，减压蒸馏除去甲醇（＜70℃），所得物冰浴冷却稀释，20%Na2CO3碱化至pH=9，分出有机相和水相，水相经乙醚提取，合并有机相，水洗、无水硫酸镁干燥、真空浓缩，得白色颗粒状晶体，产率68.6%，mp67.7℃。元素分析（C15H14O3），计算值（%）：C 74.37，H 5.82；实测值（%）

1.3 二苯羟乙酸甲酯与葡萄糖酶促反应

在装有温度计，带CaCl2干燥管的回流冷凝管100 mL三口圆底烧瓶中加入3.63 g（0.015 mol）二苯羟乙酸甲酯、6.48 g（0.036 mol）葡萄糖、3g活性酶A、50 mL无水吡啶作溶剂，用适量分子筛脱水、脱醇，油浴控温50℃，搅拌80 h，抽滤、减蒸得红褐色粘稠液体、经水洗，二甲苯洗涤（二甲苯可微热）、柱层析得淡黄色粘稠糖浆体。元素分析（C20H22O8），计算值（%）：C 61.53，H 5.68；实测值（%）：C 61.46，H 5.63。IR，（σ/cm-1，漫反射法）：3 388.6（νS，宽，缔合 OH），1 720.4（m，C=O，杂质），1 622.0（νs，C=O），1 500，1 470（苯环骨架振动）。Ms（FAB，m/z）：391（M+1），373（M-OH 10%），211（（C6H5）2C（OH）CO+，100%）。

1.4 二苯羟乙酸三氯乙醇酯与D-果糖酶促反应

二苯羟乙酸三氯乙醇酯与D-果糖酶促反应式：

将5.71 g（15.88 mmol）二苯羟乙酸三氯乙醇酯，5.79 g（32.2 mmol）D- 果糖，2 g活性酶 A，50 mL无水吡啶，适量分子筛置于100 mL三口圆底烧瓶中，控温50℃，磁力搅拌80 h，抽滤、洗涤（水洗2次，后用二甲苯洗涤），柱层析纯化得红棕色粘稠体。元素分析（C20H22O8），计算值（%）：C 61.53，H 5.68；实测值（%）：C 61.39，H 5.56。IR，（σ/cm-1，漫反射法）：3 450.0（VS，宽，缔合 OH），1 700.4（W，C=O，杂质）1 630.2（Vs,C=O），1 500，1 460（苯环骨架振动），Ms（FAB，m/z）：391（M+1），3 73（M-OH 58%），105

1.5 二苯羟乙酸甲酯与（+）—乳糖酶促反应

在100 mL三口圆底烧瓶中加入3.64 g（0.015 mol）二苯羟乙酸甲酯，10.27 g（0.03 mol）（+）—乳糖，50 mL无水吡啶，3 g活性酶B，适量分子筛脱水、脱醇，控温50℃，搅拌回流80 h，抽滤，浓缩得红棕色粘稠体。柱层析纯化，薄层分析。

2 结果与讨论

2.1 二苯羟乙酸甲酯合成

本实验采用Fischer酯化法，根据相平衡浓度和反应动力学原理，采用甲醇过量，并控制适当的滴加速度和恒温条件，充分考虑催化酶活性因素。因反应中有水生成，保持反应的无水体系也相当重要，通常加入一些脱水剂（分子筛）或通过蒸除去水的方法来保持体系无水。微波在有机合成方面文献报导颇多，利用其已成功地完成了Diels-Alder反应、Claisen反应，重排、成环、碳烯反应等，也有资料表明，超声波技术也成功地运用到了有机合成当中，并且实现了固相化学反应，对于中间体的合成，实验当中比较了上述3种方法，结果如表1所示。

表1结果表明，3种合成方法均能得到较理想的收率，超声波、微波在有机合成过程中可以提高反应速度，缩短反应时间，耗能少，污染轻，更适合自动化操作。

2.2 酶促反应（Enzymatic Synthesis）结果分析

糖酯合成，一般要首先保护部分羟基，再糖苷化，脱保护基，分离提纯过程非常繁杂，酶是具有高度不对称性和生物活性的蛋白质，在催化时表现出专一性、选择性和高效性。实验过程中，运用酶的催化活性，选择定位合成二苯羟乙酸单糖酯和双糖酯。实验所得结果见表2。

表1 二苯羟乙酸甲酯合成方法及结果Table 1 Synthetic methods and results of benzilic acid methyl ester

表2结果表明，酶促条件下，活化酯与糖的酯交换反应是可以实现的，三氯乙醇酯的活性比甲酯高，单糖酯比双糖酯的酯交换能力强。这是因为—OCH2CCl3比—OCH3结构更复杂，电负性高，更易离去，易被亲核基团所取代；二糖是单糖的二聚体，相对而言，空间位阻大，醇羟基极化效应趋同，选择定位性下降。

2.3 糖酯后处理

所得的粗产品为很粘稠的糖浆体，且伴着有色物。常规的萃取、蒸馏、重结晶等分离方法在纯化糖酯方面有很大的困难，实验发现，采用水相和有机相（乙醚）同时溶解混合物，将所得的有机相水洗除去未反应的糖，二甲苯微热洗涤除去未反应的活化酯。然后，经浓缩和高效分离手段——柱层析，分离效率可达90%以上。

3结论

（1）在合成二苯羟乙酸甲酯过程中，采用了传统的Fischer法和现代合成技术——微波催化和超声波催化，均得到了可观的产率，后两者在时间和操作方面具有大的优势。

表2 糖酯酶促合成方法及结果Table 2 Synthetic methods and results of sugar esters of benzilic acid

（2）在合成活化酯中间体的基础上，探索了活化酯与糖类进行酯交换酶促反应条件，这种合成方法比传统糖酯合成方法简便，易操作，产率要高。

[1]Nishikawar，et al.Facil enzymatic preparation of monoacylated sugars inpyridine[J].Chen Pharm Bull，1992（24）：387.

[2]胡文祥，恽榴红.抗胆碱能药物抗N样作用的分子药理学研究[J].科学通报，1984，39（1）：79-81.

[3]曹淑桂.有机溶剂中酶催化研究的新进展[J].化学通报，1995（3）：5-13.

[4]Therisod M，Klibanov Am.Regioselectiveacylation of secondary hydroxyl groups in sugars catalyzed by lipase in organic solvents[J].J Am Chem Soc,1987(109)：3977-3981.

Study on Enzymatic Synthesis of Sugar Esters of Benzilic Acid

WANG Zong-jun1，HU Wen-xiang2，ZHANG Liang-jun1
（1.Guangxi Vocational＆ Technical Institute of Industry，Guangxi Nanning 530001，China；2.Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

The derivatives of benzilic acid and fructose are significan in life sciences.Carbohdrate molecules represent a particularly challenging target for regioselective modifications due to their multitive hydroxyl groups.The l-fructopyranosyl benzilate was synthesized by enzyme-catalyzed regioselective etherification of fructose and actived esters of diphenyl glycolic acid in anhydrous pyridine with porcine pancreatic lipase.The yield of the product was 26%.

Sugar Esters of Benzilic Acid；Enzymatic Synthesis；Regioselective

TQ464.1

A

1671-0460（2010）01-0017-03

2010-02-03

王宗君（1972-），男，湖南祁东人，讲师，工程师，硕士，2007年毕业于广西大学化工工艺专业，从事有机物合成方向的研究。E-mail：gxwzj@china.com.cn。