两株酒曲毛霉的分离及BIOLOG微生物系统分析鉴定

廖永红,任文雅,伍松陵,沈 晗

(1.北京工商大学化学与环境工程学院,北京 100048; 2.国家粮食局科学研究院,北京 100037)

两株酒曲毛霉的分离及BIOLOG微生物系统分析鉴定

廖永红1,任文雅1,伍松陵2,沈 晗1

(1.北京工商大学化学与环境工程学院,北京 100048; 2.国家粮食局科学研究院,北京 100037)

利用稀释平板法从曲样和酵泥单菌落中分离获得 2株毛霉 1#和 2#,通过对其形态观察和Biolog微生物系统鉴定,确定 2株菌分别为:1#菌为卷枝毛霉 (M ucor circinelloides v.Tiegh),2#菌为密丛毛霉 (M ucor plumbeus Bonord)。所得菌株进行冷冻干燥保藏。不同菌种对Biolog 96孔碳源利用有显著差异,同一菌种不同时间对 Biolog 96孔碳源利用也有差异,分析得出 1#、2#毛霉主要利用 ɑ-酮戊二酸、L-谷氨酸。

毛霉,分离,Biolog微生物系统鉴定

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种分离用培养基 马铃薯葡萄糖培养基、察氏培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基[6-7]; Biolog鉴定用麦芽汁培养基 2%麦芽汁,2%琼脂,冷却后调整 pH至 5.5 ±0.2(28℃),121℃灭菌15min;曲粉,接种液。

浊度计、FF接种板、Biolog微生物仪 美国Biolog公司;130s型超净工作台 北京赛博伯乐实验技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 毛霉的分离与纯化 毛霉的分离纯化过程工艺流程如下:

无菌条件下,将曲捣碎,称取适量样品,选取适宜的稀释度用生理盐水稀释,以涂布平板法分别涂于马铃薯葡萄糖培养基、察氏培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基平板上,35℃培养 48h,检查菌落出现情况。取单菌落,用接种针挖掘一小块菌丝移植于另一平板培养基上,35℃培养 72h,再从长有单菌落的平板中选取典型的毛霉菌落,取孢子体制成悬液,涂布培养、镜检,重复培养 2～3次以分离纯化毛霉。将纯化了的毛霉转接到察氏斜面上培养,待生长完好后置于 4℃冰箱中保存。

1.2.2 Biolog微生物鉴定 按照 Biolog微生物自动分析系统的标准[8],对从样品中分离出的 1#、2#菌种作微生物鉴定,分析菌种利用 C源的情况。

1.2.2.1 样品菌种活化 将察氏培养基冷却后倒入小平板中(大约 10mL)。放置到 28℃的培养箱中培养 48h,以确定平板没有被污染。然后采取点植法将菌种点到察氏培养基进行活化培养。

挑取斜面上的菌,采用点植法,进行培养,时间是 48h,温度是 28℃。

1.2.2.2 鉴定方法[9]浊度调整:关闭电源,调整指针至“0”刻度;用吸水纸擦干净空白接种液管外壁,置于浊度计中,接通电源,用无菌水调整指针至100%T。菌悬液制备:取无菌棉签在接种液中蘸湿,将棉签在菌落表面转动,粘取菌体,注意不要带出培养基。倾斜接种液管并沿内壁转动棉签,使菌体附着在内壁上,同时将菌体均匀打散。通过添加菌体或空白接种液调整浊度值,使其在相应标准浊度值的 ±2%范围内。由于标准管中不是水,所以调整浊度的时候要十分小心。使用浊度标准管调整至标准浊度值 75%±2%。接种微平板:将已经调整好浊度的菌液,用 100μL的移液枪仔细地接种到 Biolog鉴定板上,放置在装离心管的长盒中,并在盒的底部铺上手纸,保持一定的湿度。微平板读数:FF微平板读数时间分别为:0h,微平板培养后 24、48、72、96、120、144、168h。Biolog Microstation系统会自动检索并读取数据,同时给出最匹配的 10个 ID名称。

1.2.3 菌种保藏 对所得菌种采用真空冷冻干燥法保藏[10]。将装有菌悬液的安碚管直接放在低温冰箱中(-80℃)或放在干冰无水乙醇浴中进行预冻。然后置于真空干燥箱中,开动真空泵进行真空干燥,最后将安碚管封口置于冰箱 (5℃左右)中或室温下避光保存。干燥后样品呈白色疏松状态。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离与纯化

样品稀释后在马铃薯葡萄糖培养基、察氏培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基上培养,发现土豆培养基上主要是有酵母菌和霉菌,其中霉菌主要是毛霉、根霉、曲霉[11];麦芽汁培养基上有较多的酵母菌生长;在察氏培养基上主要是霉菌;从 4种培养基平板中共分离出霉菌 6株,对其中两株毛霉进行研究,依次编号为 1#、2#。

2.2 菌种的形态特征

毛霉繁殖迅速,菌落质地疏松,菌丝体呈雪白色,细密,绒毛状,无假根和匍匐枝,孢子囊梗直接由菌丝体生出,孢子圆形、浅褐色。

2.3 B io log微生物自动分析系统鉴定菌种

Biolog软件将读取的 96孔微平板反应结果按照与数据库的匹配程度列出 10个结果,每个结果均显示 3种重要的参数,即可知 Probability(PROB),相似性 S imilarity(S IM)和位距 Distance(D IS)。S IM和D IS是最重要的 2个参数,S IM值表示测试结果与数据库相应数据条的相似程度,D IS值表示测试结果与数据库相应数据条的位距。Biolog系统规定:丝状真菌培养 24h时 S IM值≥0.9、培养 48h时 S IM值≥0.70、培养 76h时 S IM值≥0.65、培养 96h时 S IM值≥0.60时,系统会自动给出较为可靠的鉴定结果, S IM值越接近 1.00,鉴定结果的可靠性越高。

鉴定结果:按Biolog微生物鉴定标准方法对 1#、2#菌进行菌种鉴定,结果见表 1。

表 1 Biolog微生物自动分析系统鉴定结果

碳源分析:结果显示 1#、2#属于毛霉,同分离纯化结果相同。考察各株菌在 0～168h对 FF板上 C源的利用,其结果见图 1和图 2(图 1和图 2中的字母序号代表 FF版上不同碳源的位置)。

图 1 1#菌种 C源利用情况

图 2 2#菌种 C源利用情况

结果分析:在所有碳源中,选择菌种利用最高的10种进行分析。两株菌虽然对α-酮戊二酸、D-木糖的利用率较高,但最高峰的数值却不同。1#菌和 2#菌都可以利用α-酮戊二酸,且都在 48h时达到最大值,但 1#菌为 810,2#菌为 650。

1#菌对α-酮戊二酸、D-木糖的利用率最高,其它碳源的利用在 48h左右达到最高,此后一段时间基本保持稳定。但在 120h时L-天门冬氨酸成为了利用最高的碳源。2#菌虽然对 L-丙氨酸、D-木糖的利用率很高,但其它碳源的利用也随着时间呈现上升趋势,利用比较平均。

168h时,1#菌种和 2#菌种利用 L-丙氨酸、D-木糖、α-酮戊二酸为主要碳源。但 1#菌种对甘氨酰-L -谷氨酸、赤藻糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷利用率高于 2#菌种,而 2#菌种对N-乙酰-D-半乳糖胺的利用率高于 1#菌种。

天然 D-木糖是以多糖的形态存在于植物中。因为它们特别在农产品的废弃部分中 (例如玉米的穗轴、秸秆、棉桃的外皮)含量很多,所以用在生产上是经济廉价的原料。

由此得出,菌种对碳源的利用随着生长时间的变化而改变。各个菌种所利用的碳源种类不同,在同一时间下对相同碳源的利用率也有差别,菌种的来源以及不同生长阶段都会影响对碳源的利用。

3 结论

利用平板分离法从曲粉中分离出 2种菌,Biolog鉴定结果分别为:1#菌卷枝毛霉 (M ucor circinelloides v.Tiegh),2#菌密丛毛霉 (M ucor plum beus B onord)。

分析 1#、2#菌对 Biolog96孔碳源利用情况,得出菌种对碳源的利用随着生长时间的变化而改变。各个菌种所利用的主要碳源虽然相同,但是对其他碳源的利用还是存在差异。例如 1#菌种还可以利用赤藻糖醇,2#菌种可以利用N-乙酰-D-半乳糖胺,同一时间下菌种对相同碳源的利用率不同,菌种的来源以及不同生长阶段都会影响对碳源的利用。

后续工作中需进一步研究混合菌种的发酵特性、产香分析及感官评价,为曲中优势微生物菌群的构建以及进一步优化蛋白酶提供实验依据。

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Samples of the two types of bacteria isolated and the biolog m icroorgan ism identification system

L I AO Yong-hong1,RENW en-ya1,W U Song-ling2,SHEN Han1
(1.College of Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and BusinessUniversity,Beijing 100048,China; 2.Academy of Science Research of State Administration of Grain,Beijing 100037,China)

M ucor we re isola ted by s treak p la te m e thod,two M ucor s tra ins we re ob ta ined nam ed1#and2#, resp ec tive ly.B iolog autom a ted m ic robes identifica tion sys tem(B iolog Sys tem)was used to check twoM ucor s tra ins 1#and2#,which we re sep a ra ted and p urified from fe rm ented g ra ins of Chinese liquor.1#was identified as M ucor c irc ine lloides v.Tiegh and2#was identified as M ucor p lum beus Bonord.The results ind ica ted tha t B iolog Sys tem could be used to identify m ucor s tra ins in fe rm ented g ra ins.The las t,the s tra in through c ream e ry exp e r im ent was conse rved.D iffe rent s tra ins had d iffe rent result,1#,2#M ucorm a in useɑ-ke tog luta ric ac id,L-g lutam ic ac id.

M ucor;isola tion;B iolog m ic rob ia l identifica tion sys tem

TS201.3

A

1002-0306(2010)01-0191-03

酒曲中有丰富的微生物[1],酿造酒的独特风味及其质量与酒曲中的微生物密切相关。民间传统酒曲中主要分离得到的微生物有酵母菌、霉菌和细菌。其中霉菌中的毛霉具有较强的蛋白酶活性[2-3],采用不同的毛霉制曲,产物的风味和营养也不同,因此对酒曲中的霉菌进行种属鉴定对酒的生产和发酵工艺的改良有重要的指导意义。Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司从 1989年开始推出的一套微生物鉴定系统[4-5],可以鉴定包括细菌、酵母、丝状真菌在内的近 2000种微生物。Biolog微生物自动鉴定系统能利用计算机进行数据分析,自动化和标准化程度高,鉴定范围大、速度快,目前已成为微生物分类鉴定常用的技术手段。本实验将酒曲中的毛霉进行分离培养,然后利用 Biolog微生物自动鉴定系统对分离得到的菌株进行分类学鉴定,初步探讨Biolog鉴定系统在酒曲毛霉菌鉴定中的应用,为曲中的微生物分析奠定了基础。

2009-06-30

廖永红 (1965-),女,副教授,主要从事有关发酵工程及应用微生物技术方面的教学和科研工作。

科技部工业微生物菌种资源标准化整理、整合及共享试点项目(2005DKA21204-07)。