利用Gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库

李晨,沈海涛,张煜星,王爱英,祝建波

(石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,石河子832003)

利用Gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库

李晨,沈海涛,张煜星,王爱英,祝建波

(石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室,石河子832003)

以天山雪莲为材料,利用gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库。从经低温处理后的天山雪莲叶片中提取并分离mRNA,合成双链cDNA;cDNA经BP重组反应重组到入门载体pDONR222上,构建得到天山雪莲entry cDNA文库;天山雪莲entry cDNA再经LR重组反应将雪莲cDNA重组到植物表达载体pL EELA上,从而构建了天山雪莲cDNA表达文库。结果表明:cDNA入门文库滴度达到1.2×107cfu/mL,文库总容量为4.8×107cfu。表达文库的滴度为6.9×106cfu/mL,文库总容量为2.76×107cfu,插入片段平均大小1000 bp。阳性克隆率100%。天山雪莲cDNA表达文库的建立为进一步高通量筛选天山雪莲抗寒基因奠定了基础。

天山雪莲 ;cDNA入门文库;cDNA表达文库;gateway技术

Abstract:The construction of a cDNA library ofS aussurea involucrataKar.et Kir using gateway technology was reported in this paper.The mRNA was isolated from Saussurea involucrata Kar.et Kir leaves.Then the double-strand cDNAs(ds-cDNAs)was synthesized.The ds-cDNAs were cloned into pDONR222 vector using BP reaction of Gateway cloning technology,and the entry clone was gained.Using the LR reaction of Gateway cloning technology,the plant express vector pLEELA was ligated with the entry clone.Results showed that the entry cDNA library constructed in this report has a high titer of 1.2×107cfu/ml and contain a total clones of 4.8×107cfu and the expression library show a high titer of 6.9×106cfu/ml and contains a total clones of 2.76×107cfu,with an average inserts size of 1000bp.This cDNA library provides an important tool for filtrate the cold resistant genes.

Key words:Saussurea involucrataKar.et Kir;cDNA entry library;cDNA expression library;gateway technology

Gateway克隆技术是利用细菌λ噬菌体的整合酶-切除酶反应系统创建一种通过体外特异位点重组反应[1-2],并在该重组系统的基础上进行一系列修饰、改造,提高了这一重组系统的效率与特异性[3]。最早利用 Gateway技术构建cDNA文库的是Ohara等[4-5]。在我国,2004年梅文倩等[6]尝试利用Gateway技术大规模克隆拟南芥转录因子。天山雪莲(S aussurea involucrataKar.et Kir)是典型的耐极端低温的高山冰缘植物,主要生长于海拔2400～4100 m处,月平均气温很低,日温度变化幅度较季节温度变化急剧,通常在一天中要经历类似从夏季到冬季的温度变化,冰雹、霜冻等频繁发生。雪莲具有极强的耐寒、抗辐射、抗缺氧的能力,能在月平均温度仅3～5℃环境中快速生长,而在这种极端环境条件下生存的植物,一定发展出了抵御低温冰冻胁迫同时完成生活史的特殊的生理机制[7-8]。

在国内,近年来已有学者开始利用SMART技术构建天山雪莲全长cDNA文库并分析其表达序列标签[9-10],但未见利用 Gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库的相关报道。本实验是以天山雪莲为材料,利用gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库,以期为进一步高通量的筛选天山雪莲抗寒基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及菌株

天山雪莲(S aussurea involucrataKar.et Kir)为本实验室无菌苗。大肠杆菌(Escherichia colli)DH10B电击感受态购于Invitrogen公司。

1.1.2 主要试剂

TRlzol Reagent、Fast Track 2.0 mRNA Isolation Kits、CloneMiner cDNA Library Construction Kit、Gateway LR Clonase II Enzyme Mix 购于 I nvitrogen公司。表达载体pLEELA由中国农科院作物所傅永福研究员提供。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 材料处理

将18℃培养的天山雪莲无菌苗进行4℃处理1 d,0℃处理2 d[9]的低温梯度处理。

1.2.2 总RNA的提取及mRNA分离

取1 g冷处理过的天山雪莲叶片,液氮研磨,立即加入5 mL TRlzol Reagent,混匀,分装到5个DEPC处理的1.5 mL离心管中,按照 T RIzol Reagent说明书中的步骤进行。每管用20μL DEPC处理的水溶解总RNA。通过紫外分光光度计和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的纯度、浓度和完整性。取1 mg总RNA按照FastTrack 2.0 mRNA Isolation Kits试剂盒说明书中的方法分离mRNA,并检测mRNA的质量。

1.2.3 cDNA合成和片段分级

取天山雪莲 m RNA 5μg,将 S uperScriptⅡ等试剂加入反转录合成一链,再将 E .coli DNA Ligase、E.coli DNA Polymerase Ⅰ、E.coli RNase H等试剂加入合成cDNA第二链,后将attB1接头连接到双链cDNA上。

cDNA片段分级:采用色谱柱法,按照说明书操作,利用试剂盒提供的含有1 mL Sephacryl S-500 HR树脂的色谱柱将cDNA分级,并检测其纯度与浓度。

1.2.4 BP重组反应、电转化和入门文库的构建及质量检测

将BP Clonase Enzyme Mix和pDONR 222载体加入150 ng分级后合适大小片段的cDNA中进行BP重组反应。再将重组反应产物用电击转化法转大肠杆菌DHIOB感受态细胞。37℃、250 r/min培养1 h,加入冷冻培养基(含40%甘油的 SOC培养基),液氮速冻,-70℃下保存,即为构建的cDNA入门文库。

从入门文库中取100μL菌液用SOC培养基分别稀释到100倍、1000倍和10000倍。从中各取100μL涂到含 Kanamycin的LB平板(直径9 cm),每种稀释倍数涂2个平板。37℃过夜培养,计算其克隆数。文库的滴度=(平板上克隆数×稀释倍数)/涂板体积,根据公式计算出文库滴度,从而得出文库的总容量。

1.2.5 表达文库的构建

将入门文库接种到100 mL含有 Kanamycin的LB培养基中,37℃过夜培养,提取质粒,取200 ng,在 Gateway LR Clonase II Enzyme Mix作用下与Gateway载体pLEELA进行LR重组反应,重组载体电击转化大肠杆菌DH10B,用抗生素Ampicillin筛选,从而构建表达文库。

1.2.6 表达文库的质量评价

表达文库的滴度及总容量计算方法与初始文库相同。随机挑取10个单克隆,提取质粒。根据载体设计引物:

检测表达文库阳性克性率及平均插入片段大小。

2 结果

2.1 总RNA的提取及mRNA分离

经甲醛变性琼脂糖电泳鉴定,可看到清晰的28 S、18 S和5 S条带(图1);28 S条带明显亮于18 S条带,比例约为2∶1,这表明总 R NA的完整性良好。总RNA样品经分光光度计检测,OD260/280为1.92,浓度为16.34μg/μL,总共得到100μL。提取并分离得到的 m RNA样品经分光光度计检测,OD260/280为 1 .96,浓度为 0 .9μg/μL,共得到 1 0μL 。

2.2 cDNA合成及片段分级

对合成第二链的cDNA片段分级,收集20管片段分级样品,经从第5管开始能检测到cDNA,到第8管cDNA总量345 ng。混合第5管到第7管的样品,乙醇沉淀后用4.5μL的 T E(8.0)溶解,分光光度计检测,OD260/280为1.82,共得到286 ng样品。

2.3 文库的构建及质量评价

经检测cDNA入门文库滴度达到1.2×107cfu/mL,文库总容量为4.8×107cfu。表达文库的滴度为6.9×106cfu/mL,文库总容量为2.76×107cfu,随机提取10个克隆质粒,经 P CR扩增后电泳检测结果(图2)表明,阳性克隆率100%,插入片段平均大小1000 bp。

图1 天山雪莲总RNA的提取Fig.1 T otal RNAs extracted from Saussurea invol ucrata Kar.et K ir

图2 表达文库克隆的质粒PCR检测Fig.2 PCR analysis of recombinant plasmids from expression library

3 讨论

cDNA文库的质量主要反映在文库的代表性和重组cDNA片段的序列完整性两个方面[11]。文库的代表性可用库容量来衡量。根据Clarke-Carbon公式,为满足筛到低丰度mRNA的要求,文库应具有2.073×105以上的库容量。另外重组cDNA片段的完整性取决于mRNA的完整程度。真核生物的mRNA的完整性一般以28 S rRNA和18 S rRNA来衡量。

本实验所构建的cDNA表达文库具有以下特点:1)提取的天山雪莲总 RNA,28 S、18 S和5 S条带清晰可见,其28 S rRNA比18 S rRNA要亮1倍,可用于构建文库。2)文库克隆效率高,入门文库库容为4.8×107cfu,表达文库的库容为2.76×107cfu,完全能够满足筛选低拷贝基因的要求。3)阳性克隆率高,入门文库和表达文库阳性克隆率都为100%。4)插入cDNA片段平均大小为1000 bp。

从反映cDNA文库的质量的两个标准来看本研究所构建的天山雪莲cDNA文库是高质量的cDNA文库。

本实验应用Gateway技术构建高质量的cDNA表达文库尚属首次,研究结果为高通量的筛选和克隆天山雪莲抗寒基因奠定了基础。

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Construction of A cDNA Library ofSaussurea involucrataK ar.et Kir Using G ateway Technology

LI Chen,SHEN Haitao,ZHANG Yanxing,WANG Aiying,ZHU Jianbo
(Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,College of Life Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Q785;S580.1

A

1007-7383(2010)05-0534-03

2009-12-04

国家高技术研究发展计划(863计划)重点项目(2007AA021401),国家自然科学基金项目(30960034),新疆兵团科技攻关项目(NKB025DXNK01SW)

李晨(1984-),男,硕士生,专业方向为植物抗逆基因工程;e-mail:ldczqh@163.com。

祝建波(1967-),男,副研究员,从事植物抗逆基因工程研究;e-mail:jianbozh@shzu.edu.cn。