VC脂质体的制备与稳定性测定

杨水兵，刘成梅*，刘 伟，刘玮琳，童桂鸿，章 瑜，郑会娟

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

VC脂质体的制备与稳定性测定

杨水兵，刘成梅*，刘 伟，刘玮琳，童桂鸿，章 瑜，郑会娟

(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

以卵磷脂和胆固醇为膜材，采用薄膜-超声法制备VC脂质体。通过单因素考察生产工艺对包封率的影响以及正交设计法进行工艺优化。得出制备VC脂质体最佳工艺：制备温度65℃、卵磷脂:胆固醇=5:1、总脂材:VC=25:1、总脂材:表面活性剂(吐温-80)=10:2，在此条件下包封率可达42.1%，平均粒度为373.9nm；将脂质体在4℃下密闭放置15d，以脂质体的粒径变化为指标考察其稳定性。结果表明，脂质体悬液粒径无明显变化，脂质体悬液稳定性良好。

VC；脂质体；薄膜水化法；包封率；稳定性

VC是一种水溶性的维生素，它可合成胶原蛋白和黏多糖，减少自由基对皮肤的损害，延缓衰老，还可抑制皮肤异常色素的沉积和酪氨酸酶的活性，减少黑色素的形成，被广泛应用在美白和抗氧化护肤化妆品中[1-2]。人体对VC的全部需要量都由食物供给，食物中的VC可迅速被胃肠道吸收。但在某些特殊情况下，如腹泻、肠手术、养料吸收障碍、胃肠炎、消化道溃疡等情况下会使VC的吸收减少。VC性质不稳定，在储藏和加工过程中受热、见光易氧化、分解，导致其利用率显著降低[3-4]。VC是水溶性的，不易渗透到皮肤角质层，故不能充分发挥效用。

为减少维生素的损失，提高其在人体中的吸收利用率，本研究将VC包裹在脂质体中，脂质体不同于普通的膏霜基质，它的结构类似生物膜，又称人工生物膜，在水中平衡后具有亲水性和疏水性两性性质。它是以生物相容的磷脂和胆固醇为载体，将药物溶解或包裹于脂质核，或是吸附、附着于纳米粒表面的一种新型载药系统，具有缓释、控释、提高药物稳定性，增强疗效降低毒副作用等方面的优越性，同时在生物体内及贮存过程中较稳定[5-6]。

脂质体常用的制备方法有薄膜法[7]、超声法[8]、乙醇注入法[9]、高压乳匀法等[10]。薄膜法制备的脂质体包封率较高，但一般粒径较大。超声法制备的脂质体粒径较小，但其包封率低，且不稳定[11]。本实验结合脂质体作为新型药剂载体的优越性，以大豆卵磷脂和胆固醇作为膜材，采用薄膜-超声法制备包封率高、稳定性好的VC脂质体，为VC脂质体的生产提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆磷脂(纯度＞92%) 北京美亚斯磷脂技术有限公司；胆固醇 北京奥博星生物技术责任有限公司；VC、固蓝B盐 国药集团化学试剂有限公司；吐温-80 上海申字医药化工有限公司；EDTA 成都科龙化工试剂厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、冰乙酸天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

RE-52C旋转蒸发仪、SHE-Ⅲ型循环水真空泵 巩义市予华仪器厂；KQ-50E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Nicomp380 ZLS超细微粒粒度分析仪美国Santa barbara公司；漩涡混匀器 广州仪科实验室技术有限公司；T6紫外-可见分光光度计 普析通用仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 VC脂质体的制备[12-13]

称取一定比例大豆磷脂、胆固醇，置于250mL梨型瓶中；加入无水乙醇溶解，将梨形瓶置于65℃水浴中，在旋转蒸发仪上减压蒸发除去有机溶剂，待有机溶剂挥发完，形成脂质干膜后，关闭旋转蒸发仪；加入含一定量VC及表面活性剂吐温-80的PBS，在减压的条件下旋转洗膜15min，形成乳白色悬浊液；将乳白色悬浊液转移至棕色容量瓶中，经过超声处理即形成均匀的白色脂质体乳浊液。以包封率和粒径为考察指标，筛选包封VC的最佳配方。

1.3.2 脂质体的粒径测定[14-15]

将脂质体以缓冲液稀释后，用激光纳米粒度分析仪测定其粒径及粒径分布。测试角度90°，测试温度为(25±0.1)℃，测试光波长为632.8nm。

1.3.3 脂质体包封率测定

1.3.3.1 VC标准曲线绘制

图1 VC含量标准曲线图Fig.1 Standard curve of vitamin C

精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mL抗坏血酸标准使用溶液(相当于抗坏血酸0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、150.0、200.0μg)，分别置于10mL比色管中。各加0.3mL EDTA溶液(0.25mol/L)、0.5mL乙酸溶液(0.5mol/L)、1.25mL固蓝B盐溶液(2g/L)，加水稀释至刻度，用漩涡混匀器混匀。室温(20～25℃)下放置20min后，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长420nm处测量吸光度，以标准各点吸光度绘制标准曲线。

由图1可知，在测定范围内，吸光度(y)与溶液中VC含量(x)满足线性关系，y=0.0078x－0.0110，R2=0.9986，相关性很高。

1.3.3.2 包封率测定(透析-分光光度法)

取脂质体悬浮液10mL置于已处理过的透析袋(cut off范围12000～14000)中，封口，将其置于烧杯中，于室温下透析10h。取出1mL透析内液，测定波长420nm处的吸光度，代入标准曲线计算出包封的VC含量，从而计算出VC的包封率[16]。

式中：m包、m总分别表示包封于脂质体的VC含量及总VC用量。

1.3.4 试验设计

1.3.4.1 单因素试验

分别以制备温度、卵磷酯与胆固醇质量比(卵胆比)、表面活性剂(吐温-80)用量、无水乙醇用量、VC与总脂材比为因素，考察各因素对脂质体包封率和粒径的影响。1.3.4.2 正交试验

在单因素试验的基础上，选取对脂质体包封率和粒径影响较大的4个因素(VC含量、卵磷脂与胆固醇的比例、制备温度以及表面活性剂加入量)，进行四因素三水平正交试验设计。

2 结果与分析

2.1 最佳制备温度的确定

图2 制备温度对包封率、粒径的影响Fig.2 Effect of preparation temperature on encapsulation efficiency and particle size

在VC质量浓度2mg/mL、卵磷脂:胆固醇=4:1、卵磷脂:无水乙醇=2.5g/100mL、表面活性剂:总脂材=3:10、VC:总脂材=1:10(即卵磷脂1.6g、胆固醇0.4g、无水乙醇64mL、表面活性剂0.6g和VC 0.2g)条件下，考察制备温度50、55、60、65、70℃对包封率及粒径的影响，结果见图2。

结合包封率和粒径这两个因素的变化，50～65℃之间包封率总体呈上升趋势，而大于65℃则开始下降，粒径随温度升高而增大，于60℃达到最大，超过60℃开始减小。虽然65℃粒径不是最小值，但是其与最小值较接近，而且包封率为最大，故取65℃为制备温度。脂质体的物理性质与介质温度有密切关系，当升高温度时脂质体双分子层中疏水链可从有序排列变为无序排列，从而引起脂质膜物理性质的一系列变化，膜由“胶晶”态变为“液晶”态，其厚度减小、流动性增加等，发生这种转变时的温度称为相变温度。

在相变温度以下时，膜结构处于晶态；在相变温度以上时，处于流体态和液晶态。当发生相变时，可有液态、液晶态和晶态共存，出现相分离现象，使膜的通透性增加，被包裹物渗漏，故膜的流动性直接影响脂质体的稳定性。除此之外，过高温度会造成VC的损失，而过低温度成膜时间长且不均匀，故选取65℃为制备温度。

2.2 卵胆比对包封率、粒径的影响

在VC质量浓度2mg/mL、卵磷脂:胆固醇=4:1、卵磷脂:无水乙醇=2.5g/100mL、表面活性剂:总脂材=3:10、VC:总脂材=1:10和温度65℃条件下，考察以卵磷脂:胆固醇为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1制备VC脂质体，对其包封率、粒径的影响，结果见图3。

图3 卵胆比对包封率、粒径的影响Fig.3 Effect of phospholipids/cholesterol ratio on encapsulation efficiency and particle size

胆固醇对磷脂的相变具有双向调节作用。在相变温度以上时，它能抑制磷脂分子中脂肪酰链的旋转异构化运动，降低膜的流动性；在相变温度以下时，膜脂处于晶态排列，它又可诱发脂肪酰链的歪扭构象的产生，阻止晶态的出现。胆固醇分子中的羟基还可与磷脂分子中的羰基以氢键形成复合物。脂肪酰链自由运动的减少，引起膜的压缩，面积减小，结合紧密，流动性降低而使渗透性降低。

而在一定比例范围内，胆固醇比例越大，包封率越高，因为胆固醇表面活性剂作用使W/O乳液能稳定形成；但胆固醇比例过大时，组成脂质体的磷脂量太少，脂质体膜形成困难，而且不牢固，且由此形成的脂质体膜亲水性太强，膜也容易破坏。综上，并结合以上图形可知，当卵磷脂:胆固醇小于5:1，包封率一直上升，于5:1达到最大，随后开始呈下降趋势。当卵磷脂:胆固醇=5:1时粒径为最小值，大于此值时粒径增大。故选取制备脂质体适宜的卵胆比为5:1。

2.3 表面活性剂与总脂材的比对包封率、粒径的影响

在温度65℃、卵磷脂:胆固醇=5:1、VC:总脂材=1:20条件下，固定其他组分的比例不变，只改变表面活性和总脂材的比例，制备VC脂质体，研究表面活性剂[17]对包封率的影响，结果见图4。

图4 表面活性剂与总脂材的比对包封率、粒径的影响Fig.4 Effect of total lipid/surfactant ratio on encapsulation efficiency and particle size

聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，吐温-80是一种非离子型亲水性表面活性剂，含亲水性和疏水性的长链。脂质体中加入吐温-80后，吐温-80物理吸附于脂质双层表面，其聚氧乙烯基从脂质双层中伸出，致密覆盖在双层表面，形成有一定厚度的亲水相。它属于“立体屏障”型脂质体，比传统脂质体更稳定。但是过多的加入其会造成脂质体的泄露，当表面活性剂:总脂材小于3:10时，包封率随之增大而上升，超过其则下降，粒径在其值小于3:10时一直下降，大于其则上升，所以取表面活性剂:总脂材=3:10为佳。

2.4 无水乙醇用量的确定

在温度65℃、卵磷脂:胆固醇=5:1、VC:总脂材=1:20条件下，固定其他组分的比例不变，只改变卵磷脂和无水乙醇的比例，制备VC脂质体，研究乙醇用量对成膜、包封率及粒径的影响，结果见图5。

图5 磷脂与无水乙醇用量比(g/100mL)对包封率及粒径的影响Fig.5 Effect of phospholipids/alcohol ratio on encapsulation efficiency and particle size

无水乙醇作为成膜时的有机溶剂，对成膜均匀度，成膜好坏有最直接的影响，少量无水乙醇不能溶解磷脂，过多的无水乙醇则不易除去，均会影响到脂质体的均匀性，且由于其为有机溶剂，用量过多会造成试剂残留。根据本试验结果，在比例为2.5g/100mL时，包封率为最大值，粒径为最小值，经试验确定最后用量为2.5g/100mL为最佳。

2.5 VC与总脂材的比对包封率及粒径的影响

在温度65℃、卵磷脂:胆固醇=5:1条件下，固定其他组分的比例不变，只改变VC和总脂材的比例，制备VC脂质体，研究VC与总脂材的比[18](质量比)对包封率和粒径的影响，结果见图6。

图6 总脂材与VC比对包封率及粒径的影响Fig.6 Effect of total lipid/vitamin C ratio on encapsulation efficiency and particle size

VC与总脂材的比对脂质体的外观和包封率影响也较大，随着大豆卵磷脂比的增加，包封率增大，粒径也同时增大，但是VC与总脂材的比过大则VC容易析出，不能制成较好的VC脂质体，包封率不高；比例过小制得的脂质体外观不均匀，粒径较大，且由于磷脂、胆固醇量较大造成绝对包封量少。综合这两方面因素，取总脂材:VC=20:1为制备比例。

2.6 VC脂质体正交试验

通过正交设计确定VC脂质体配方。在前期实验基础上，确定了影响VC脂质体包封率主要因素：体系中VC的含量、卵磷脂与胆固醇的比例、制备温度以及表面活性剂加入量。因此，用L9(34)表正交试验设计法进行试验(表1)，确定VC脂质体的最佳配方。

表1 VC脂质体正交试验设计Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

按上述方法测定正交设计法中每个组处方制备出的脂质体中VC的含量。结果见表2。

表2 VC脂质体正交试验结果及分析Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for encapsulation efficiency with various preparation conditions

从表2和表3可以看出，影响因素主次顺序为D＞C＞B＞A。最佳组合为A2B2C3D1，即温度65℃、卵磷脂:胆固醇=5:1、总脂材: VC =25:1、表面活性剂:总脂材=2:10，此组合下得到的包封率可达42.1%。

2.7 脂质体的贮藏稳定性[19-20]

对按最优试验组制备的脂质体悬液置于4℃下贮藏，并于不同时间(0、3、6、9、12、15d)取样进行粒径测定，结果见表4。最优试验组：磷脂:胆固醇=5:1、总脂材: VC =25:1、表面活性剂:总脂材=2:10、制备温度65℃，与正交分析最佳组合组相一致。

表4 贮藏稳定性试验Table 4 Storage stability of vitamin C liposomes

由表4可知，脂质体储藏时会随着时间的延长造成絮凝结块，而在冷藏条件下可延缓此变化，从粒径出发考察了该脂质体在冷藏条件下的粒径变化以得到其冷藏稳定性，结果发现粒径在15d内变化不大，可说明脂质体的冷藏稳定性较好。

3 结 论

本实验以卵磷脂、胆固醇为膜材，VC为芯材，采用单因素考察和正交设计对薄膜水化-超声法进行了制备工艺的优化，得到的最佳工艺条件：制备温度为65℃、卵磷脂:胆固醇=5:1、总脂材:VC=25:1、总脂材:表面活性剂=10:2，在此条件下脂质体包封率可达42.1%，平均粒度为373.9nm；且脂质体在4℃下贮藏，15d内具有良好的稳定性。

[1] ZHANG L, SHELDON L, WILLIAM V R, et al. Electroporationmediated topical delivery of vitamin C for cosmetic applications[J].Bioelectrochem Bioenerg, 1999, 48(2): 453-461.

[2] 蔡呈芳. 皮肤美白化妆品的进展[J]. 临床皮肤科杂志, 2004, 33(6):386-387.

[3] 彭景. 烹饪营养学[M]. 北京: 中国纺织出版社, 2008.

[4] 张文晔, 宋树豪. VC的代谢与功能及其在家禽生产上的应用[J]. 饲料工业, 2010, 31(6): 4-6.

[5] 姜殿君, 王俊平, 赵丽妮. 抗癌药物脂质体及其研究进展[J]. 中国现代医药杂志, 2007, 9(4): 152-154.

[6] GAMEZ-HENS A, FERNANDEZ-ROMERO J M. Analytical methods for the control of liposomal delivery system[J]. Trends Anal Chem,2006, 25(2): 167-178.

[7] PUPO E, PADRON A, SANTANA E, et al. Preparation of plasmid DNA-containing liposomes using a high-pressure homogenization-extrusion technique[J]. J Control Release, 2005, 104(2): 379-396.

[8] 熊非, 朱家璧, 汪豪, 等. 灯盏花素前体纳米脂质体的质量评价[J].中国药科大学学报, 2004, 35(6): 513-516.

[9] 吴亚妮, 徐云龙, 孙文晓. 木瓜蛋白酶纳米脂质体的制备及其粒度控制[J]. 上海交通大学学报: 农业科学版, 2007, 25(2): 1052-1091.

[10] 张小宁, 张郁, 姬海红, 等. 微射流法制备莪术油纳米脂质体的研究[J]. 中国药学杂志, 2004, 39(5): 356-358.

[11] HUANG C H. Studies on phosphatidylcholine vesicle. Formation and physical characteristics[J]. Biochemistry, 1969(8): 344-352.

[12] SRIAMORNSAK P, THIRAWONG N, NUNTHANID J, et al. Atomic force microscopy imaging of novel self-assembling pectin-liposome nanocomplexes[J]. Carbohyd Polym, 2008, 71(2): 324-329.

[13] 张耕, 易以木. 苦参素磷脂纳米粒的研制[J]. 中国医药学杂志, 2004,24(9): 573-574.

[14] 刘成梅, 王瑞莲, 刘伟, 等. 中链脂肪酸脂质体的制备及其特性评价[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 143-146.

[15] MU X M, ZHONG Z S. Preparation and properties of poly (vinyl alcohol)-stabilized liposomes[J]. Int J Pharm, 2006, 318(1/2): 55-61.

[16] MURA P, MAESTRELLI F, GONZALEZ-RODRIGUEZ M L, et al.Development, characterization andin vivoevaluation of benzocaineloaded liposomes[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2007, 67(1): 86-95.

[17] 邓秋, 岳王月, 胡新, 等. 鲑鱼降钙素柔性纳米脂质体与表面活性剂的相互作用[J]. 中国新药杂志, 2003, 12(11): 924-927.

[18] 平其能. 现代药剂学[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 1998: 573-575.

[19] 于波涛, 张志荣, 曾仁杰, 等. 脂质体稳定性的研究进展[J]. 西南国防医药, 2005, 15(6): 686-688.

[20] HEMANDEZ C T, VILLALAIN J, GOMEZ F J. Stability of liposome on long term storage[J]. J Pharm Pharmacol, 1990, 42(6): 397-400.

Preparation and Stability of Vitamin C Liposomes

YANG Shui-bing，LIU Cheng-mei*，LIU Wei，LIU Wei-lin，TONG Gui-hong，ZHANG Yu，ZHENG Hui-juan
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Lecithin and cholesterol were used the membrane-forming materials to prepare vitamin C liposomes by thin film hydration-ultrasonic method. Based on single-factor experiments, the optimal preparation conditions for vitamin C liposomes were determined by orthogonal array design to be preparation temperature, 65 ℃; lecithin/cholesterolthe mass ratio, 5:1; total lipid/vitamin C mass ratio, 25:1; and total lipid/ surfactant mass ratio 10: 2. An encapsulation efficiency of vitamin C liposomes as high as 42.1% was achieved under these optimal preparation conditions, and the average particle size of the prepared vitamin C liposomes was 373.9 nm. The stability of vitamin C liposomes was investigated by evaluating the change of its average particle size during storage at 4 ℃ for 15 days. The average particle size of vitamin C liposomes had no significant change, suggesting excellent stability.

vitamin C；liposome；thin film hydration-ultrasonic method；encapsulation efficiency；stability

R944.1

A

1002-6630(2010)20-0230-05

2010-07-08

国家“863”计划项目(2008AA10Z330)；国家重点实验室目标导向项目(SKLF-MB-200808)作者简介：杨水兵(1984—)，男，博士研究生，研究方向为食物(含生物质)资源的开发与利用。

E-mail：shuibingyang1984@126.com

*通信作者：刘成梅(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食物(含生物质)资源的开发与利用。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn