银杏叶总黄酮提取工艺的正交设计研究

李宁,李楚

(1.山西医科大学药学院,山西 太原030001;2.山西省中医药研究所,山西 太原030001)

银杏叶为银杏科植物银杏的叶片,主要化学成分为黄酮类、萜类,其中总黄酮含量最高[1～3]。天然来源的生物黄酮分子量小,能被人体迅速吸收,能通过血脑屏障,进入脂肪组织,进而体现消除疲劳、保护血管、防止动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器的功能。试验通过参考相关文献[4～6],最终采用乙醇水溶液作为溶剂,通过正交设计方法,考察总黄酮在提取物中的含量,以确定银杏叶的最佳乙醇回流提取工艺。

1 材料与仪器

银杏叶采自太原儿童公园,芦丁标准品(中国生物制品检定所,批号:0080-9705),亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、正丁醇(无水)、乙醇(分析纯)。

主要仪器:旋转蒸发仪RE-52AA,电子天平,UV-760CRT双光束分光光度计,恒温水浴槽,电热恒温鼓风干燥箱。

2 实验方法

2.1 试验因素及方案

参考前人研究结果[7],确定影响总黄酮提取效率的考察因素有4个,分别为:溶剂浓度(A)、料液比(B)、提取次数(C)、提取时间(D),正交实验考察因素见表1。考虑各种影响因素,选择了L9(34)的正交试验方案[8]。

2.2 供试品溶液的制备

将采摘的银杏叶片放入60～70℃的干燥箱中烘干24 h,粉碎后过40目筛,取15.6 g银杏叶粉末置于提取容器内,加不同浓度乙醇适量回流提取,过滤。残渣再加不同浓度乙醇适量回流提取,过滤。残渣用醇液洗涤数次,转移至250 mL容量瓶中,用乙醇定容。用UV-760CRT双光束分光光度计在510 nm处进行测定[9～11],以60%乙醇作参比液,采用硝酸铝比色法[12～14],测定总黄酮的含量。

表1 正交实验考察因素Table 1 Levels oforthogonal experiment

总黄酮含量(%)=供试品吸光度×标准品相当芦丁量/标准品吸光度×供试品量

2.3 对照溶液的制备

精密称取芦丁对照品20 mg,置于10 mL的容量瓶中,加入60%的乙醇溶液6 mL,微热使其溶解,再用60%的乙醇定容至刻度,摇匀,得浓度为2 mg·mL-1的芦丁标准贮备液[15～17]。

2.4 标准曲线的制备

精密吸取对照溶液 0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL 分别置于编号 1、2、3、4、5、6号的 10 mL具塞刻度试管中,先加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL,摇匀,放置6 min,再加10%硝酸铝溶液0.3 mL,摇匀,再放置5 min,加4%氢氧化钠溶液4 mL,各加60%乙醇定容至10 mL,放置15～20 min,在波长510 nm处测定各试管中溶液的吸光度。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得回归方程:A=8.0643c+0.0339(r=0.9920,n=6)。在0.05～0.3 mg·mL-1范围内,线性关系良好。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

2.5 精密度试验

准确量取同一浓度的芦丁标准品溶液0.2 mL,置于10 mL量瓶中,在 510 nm波长处连续6次,测定吸光度,测得精密度RSD=0.28%。

2.6 稳定性试验

取同一浓度的供试品溶液,每隔4 h测定一次,结果 6次测定的吸收值基本不变,RSD=0.32%,表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

准确量取2.2中的供试品溶液10 mL,分别取6份,准确加入芦丁标准品1 mg,按供试品提取测定方法,计算回收率,得平均回收率=96.76%,RSD=1.09%(n=6)。

3 结果与分析

3.1 试验结果分析

按照正交试验方案对总黄酮提取条件进行了研究,结果见表2。

表2 正交试验设计及试验结果分析L9(34)Table 2 Orthogonal design and analysis of results L9(34)

由表2可看出,K1、K2、K3表示各个因素分别取3个水平时相应的试验结果之和;k1、k2、k3为K1 、K2 、K3的算术平均值;极差 R是k1、k2、k3中最大值与最小值之差,它反映了试验中各因素影响的大小。它们的大小顺序反映出相关因素分别取三个水平时提取率的高低。

3.2 试验因子影响的比较分析

为了比较正交实验中4个实验因素对实验结果的影响,确定哪些或哪个参考因素对实验提取结果的影响是最显著的或比较显著的,从而寻找出最佳实验操作条件,进行了方差分析,结果见表3。

表3 正交试验方差分析Table 3 Variance analysis oforthogonal experiment

由表3方差分析可知,各因素影响的顺序为:A＞C＞B＞D,即乙醇的浓度对提取率的影响最大,提取时间影响最小。A2B2C2D1的组合最佳,即称取15.6 g银杏叶粉末加60%乙醇,料液比为1∶8,提取2次,每次1h为提取的最佳条件。

3.3 试验结果的稳定性验证

将采摘的银杏叶片放入60～70℃的干燥箱中24 h,粉碎后过40目筛,置于提取容器内,按已确定的最佳提取工艺,过滤,重复一次。残渣用醇液洗涤数次,转移至250 mL容量瓶中,乙醇定容。重复试验3次,数据见表4。

表4 银杏叶总黄酮最佳提取工艺的验证Table 4 Best extraction technique of FG

表4结果表明:验证试验结果与正交试验结果相近,确定该提取工艺基本稳定、可行。

4 讨论

以银杏叶总黄酮提取液在510 nm波长处的吸光度为参考指标,通过总黄酮提取工艺的正交试验研究,确定了从银杏叶中提取总黄酮的最佳条件为:以60%乙醇为溶剂,料液比为1∶8,提取2次,每次1 h,提取处理银杏叶15.6 g。通过稳定性实验,确定总黄酮至少在24 h内是稳定的。该提取方法操作简便,结果准确可靠。为进一步研究银杏叶中总黄酮提取工艺提供理论依据。银杏叶含有丰富的黄酮[18～20],具有广泛开发和利用价值,值得综合利用,应该加强其资源开发。

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