纳米二氧化钛和单壁碳纳米管对普通小球藻生长的抑制效应

杨晓静，陈灏，闫海，*，秦波

1.中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京100085

2.北京科技大学应用科学学院生物科学技术系，北京100083

纳米二氧化钛和单壁碳纳米管对普通小球藻生长的抑制效应

杨晓静2，陈灏1，闫海2，*，秦波2

1.中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室，北京100085

2.北京科技大学应用科学学院生物科学技术系，北京100083

纳米材料独特的理化性质使其得到了广泛的应用，但其可能带来的生物安全性问题引起了社会各界的广泛关注.采用污染物藻类毒性测试的标准实验方法，研究了纳米二氧化钛（nano-TiO2）和单壁碳纳米管（SWCNTs）对普通小球藻（Chlorella vulgaris）生长的抑制效应.结果表明，在0.01～500mg·L-1浓度范围内，nano-TiO2对普通小球藻的生长没有明显的抑制现象，而SWCNTs却对普通小球藻的生长存在明显的抑制效应，其96h半效应浓度（96h-EC50）为261.5mg·L-1.光学和电子显微镜观察发现，与nano-TiO2相比，SWCNTs能够发生凝聚并吸附大量的普通小球藻细胞，因此严重抑制了普通小球藻的正常生长.

普通小球藻；纳米二氧化钛；单壁碳纳米管；毒性效应

1 引言（Introduction）

20世纪80年代以来，纳米技术和纳米材料迅速发展，应用领域不断扩大，由此带来的生物安全性已经成为国内外研究的热点.纳米材料是指几何尺寸达到100nm以下水平，并具有特殊性能的纳米效应材料（白春礼，2001）.由于纳米材料独特的理化性质和强度高、电磁学性能好等优点，在电子、磁学、光学、生物医学、药学、化妆品、能源、传感器和催化等领域已被广泛应用（邹莉，2004）.纳米材料可以通过各种途径进入环境及生物体内，构成对环境和人体健康潜在的影响和风险，因此纳米材料的生物学效应和环境安全问题不可忽视，与之相关的毒理学研究十分重要（朱小山等，2008）.

近年来，国内外已对单壁碳纳米管（SWCNTs）、纳米二氧化钛（nano-TiO2）等纳米材料的毒性效应进行了深入研究（Nel et al.,2006;Smart et al.,2006;Hurt et al.,2006;汪冰等，2005;诸颖和李文新，2008）.研究表明，SWCNTs不仅可导致大鼠肺组织损伤和肉芽肿的形成（Lam et al.,2004;Warheit et al.,2004），而且可引起小鼠肝脏组织蛋白质的氧化损伤和大鼠主动脉内皮细胞的损伤（赵明明等，2008;林治卿等，2006）.nano-TiO2可导致小鼠肺部组织的纤维化并有可能诱发肺癌（朱融融等，2006），沉积在肺部的nano-TiO2颗粒在体液和血液的带动下，可进一步转运至心脏、肝脏和肾脏等器官，引起相应的毒性症状（王江雪等，2008）.

微细藻类作为水生态系统中主要的初级生产者，可以通过光合作用固定二氧化碳合成有机物，对整个水生态系统的平衡和稳定具有至关重要的作用.在微细藻类中，小球藻在淡水、海水中均有分布，是人类最早筛选分离出的微细藻类.小球藻具有生态分布广和生长周期短等特点，可以作为典型的实验藻种来直接观察细胞水平上的中毒症状，是较理想的水环境生态毒理学研究的实验生物（谢艳等，2008）.

作为一种新型污染物，纳米材料可进入各种受纳水体，对水生生态系统各级生物产生影响.目前有关纳米材料对哺乳动物、鱼类等高端生物的毒性已有大量研究（Lam et al.,2004;玉晓微等，2009），但对作为水生初级生产力的微细藻类的毒性效应研究报道极少，因此本文初步研究了SWCNTs和nano-TiO2这两种重要的纳米材料对普通小球藻生长的毒性效应，这对于评价纳米材料的生态风险及安全性具有重要的意义.

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 实验材料

普通小球藻（Chlorella vulgaris Beij）购自中科院武汉水生生物研究所.nano-TiO2为锐钛型（粒度为20～30nm），由北京赛特瑞试剂公司提供；SWCNTs（直径＜2nm，长度0.5～50μm），由深圳市纳米港有限公司提供.

2.2 培养条件

采用水生4号培养基（周永欣和章宗涉，1989），初始pH值调为7.0.将小球藻藻种接种到培养基中，连续传代培养3次待进入对数生长期时进行实验.实验所用容器为100mL三角瓶，培养量为30mL，每组设3个平行样.小球藻培养温度为25℃，光照强度为4000Lux，光暗比12h∶12h.每天摇瓶2次.实验所用培养基和器皿等均经过121℃、20min高温高压灭菌，然后在洁净工作台内经过20min的紫外线杀菌后使用.实验开始后每天定时取样，在光学显微镜放大400倍下通过血球计数板计数藻细胞浓度.

2.3 毒性实验

纳米材料各浓度组采用水生4号培养基配制，接种前超声波充分振荡.

采用有毒化学品对藻类毒性测试的标准实验方法，确定纳米材料抑制普通小球藻生长的96h半效应浓度（96h－EC50）（周永欣和章宗涉，1989）.nano－TiO2实验：初始藻密度1.9×106个·mL-1；浓度系列：0、0.01、1、50、100、500mg·L－1；培养时间96h.SWCNTs实验：初始藻密度2.1×106个·mL－1；初步实验纳米材料初始浓度配制呈几何级数增加，根据96h实验结果采用直线内插法初步计算出纳米材料抑制普通小球藻生长的96h－EC50.正式实验纳米材料的浓度以初步实验确定的96h－EC50为中心，各向两边以等差数列的形式延伸2个浓度，共1组对照（0mg·L－1）和5组浓度（150、200、250、300、350mg·L－1）进行；培养时间96h.每天定时取样，在光学显微镜放大400倍下通过血球计数板计数藻细胞浓度.以藻细胞浓度为指标，采用机率单位法得到纳米材料的剂量反应方程，通过此方程计算出96h－EC50，并对计算出的96h－EC50进行X2检验.

2.4 电镜实验

取培养96h的各实验组藻液5mL，8000rpm离心10min，弃上清，加入2.5%戊二醛固定2h，8000rpm离心5min，弃上清.用磷酸盐缓冲液清洗3遍，每次8000rpm离心5min弃上清，然后加入5mL无菌水，充分混匀，在锡纸上滴加10μL样品，自然晾干.真空干燥箱内40℃干燥6h.干燥好的样品用导电胶粘附在电镜样品台上喷碳，在SEM扫描电镜上进行观察.

3 结果与分析（Results and analysis）

3.1 nano-TiO2对普通小球藻生长的影响

不同nano-TiO2浓度下，普通小球藻生长至96h的藻细胞浓度如图1所示.由图1可见，在0.01～500mg·L－1浓度范围内，nano-TiO2对普通小球藻的生长没有产生明显的有规律性的抑制效应，藻细胞浓度均维持在1.7×106个·mL－1左右.

3.2 SWCNTs对普通小球藻生长的影响

初步实验采用直线内插法得到SWCNTs抑制普通小球藻生长的96h-EC50约为250mg·L－1，在此基础上，进一步研究了SWCNTs对普通小球藻生长的抑制效应，结果如图2所示.由图可见，随SWCNTs浓度的升高，普通小球藻藻密度显著降低（p＜0.05）.当浓度为300mg·L－1时，普通小球藻的生长受到明显的抑制.

根据图2计算得到的SWCNTs浓度对数（x）、细胞浓度、抑制率和机率单位（y）等指标见表1，将SWCNTs浓度对数（x）与机率单位（y）进行一元线性回归，得到如下剂量反应方程：y=2.7733x－1.7042，R2=0.9909.当机率单位为5时，通过上述方程计算得到SWCNTs抑制普通小球藻生长的96h-EC50为261.5mg·L－1.

表1 单壁碳纳米管抑制普通小球藻生长的实验结果Table 1Result of inhibition effect of SWCNTs on the growth of Chlorella vulgaris

为了验证计算所得到的96h-EC50的可靠性，对上述剂量反应方程进行X2检验，结果见表2．查X2表，当自由度为3时，=7．82，而X2计算值为0．59，＞X2，故上述剂量反应方程符合精度要求，计算得到的96h-EC50真实可靠．

3.3 纳米材料抑制普通小球藻生长的显微观察

为了进一步研究纳米材料抑制普通小球藻生长的过程和机理，我们分别在光学和电子显微镜下对纳米材料和普通小球藻相互作用的现象进行了观察.在光学显微镜放大400倍下，普通小球藻细胞呈圆形分散分布（图3a），SWCNTs会发生一定的凝聚形成较大的颗粒（图3b）.当SWCNTs与普通小球藻同时存在时，发现在团聚的SWCNTs周围吸附了大量的普通小球藻细胞，形成了更大的颗粒物（图3c）.而nano-TiO2基本呈现分散分布且不发生团聚（图3d），当与普通小球藻同时存在时，二者也基本呈现分散分布状态，没有形成大颗粒的凝聚现象（图3e）.

表2 剂量反应方程的X2检验Table 2The X2test of the linear dose-response equations

电镜观察结果与光学显微镜观察结果基本一致.普通小球藻细胞呈圆形分散分布（图4a），SWCNTs发生凝聚形成较大的颗粒（图4b），当SWCNTs与普通小球藻共存时，在团聚的SWCNTs颗粒周围吸附了大量的普通小球藻细胞，形成了更大的颗粒物（图4c）.而nano-TiO2与普通小球藻同时存在时，虽然普通小球藻周围也存在一些nano-TiO2（图4d），但基本呈现分散分布，没有形成由上述两种物质组成的较大颗粒（图4c）.因此SWCNTs吸附大量的普通小球藻细胞形成较大的颗粒，影响了普通小球藻的光合作用及代谢可能是SWCNTs对普通小球藻生长抑制程度远高于nano-TiO2的主要原因.

4 讨论（Discussion）

通常认为纳米材料的毒性与纳米颗粒的粒径和比表面积有关，粒径越小，比表面积越大，与细胞接触的区域越多，更有利于纳米颗粒的吸收和转运，更容易引起细胞膜结构的改变，纳米材料毒性效应也就越大（Teeguarden et al.,2007）.SWCNTs有较大的比表面积，由于其具有独特的表面化学和电输运特性，可能引发电子转移导致细胞结构损伤、功能紊乱甚至坏死（Lam et al.,2006）.SWCNTs会引起巨噬细胞的染色质浓缩、细胞器缩小、细胞质中小泡缩小变形等现象，并可能与细胞凋亡有关（孟幻等，2006）.另外，SWCNTs表面带有大量具有强氧化还原性质的电子簇，可能会与细胞表面的载体通道、各种受体结合，使蛋白质的结构发生变化，导致羰基含量增多；进入细胞的SWCNTs也可能与酶结合使酶失活，还有可能通过二次氧化或还原产生大量的有害自由基从而改变组织内蛋白质的结构，破坏细胞内有序结构和正常的代谢功能（冯晶等，2006）.

nano-TiO2具有很强的吸附能力和良好的光学催化特性，因为纳米颗粒大小与生物分子相差不大，其被生物体摄取后很容易进入到细胞中，因此造成毒性效应.Lu等（2003）用nano-TiO2培养大肠杆菌，结果发现大肠杆菌细胞壁被降解，出现细胞膜损伤，细胞的通透性受到破坏，引起细胞内容物外流，最终导致细胞死亡.目前，对nano-TiO2的生物毒性作用机制尚未完全了解，但其具有的光学催化特性、活性氧簇ROS的产生及体内氧化应激反应的增强可能是其最主要的致毒作用机制（Nel et al.,2006）.当用波长小于400nm的紫外线照射nano-TiO2时，在水溶液环境下，nano-TiO2颗粒表面会产生具有强氧化能力的自由基-·OH和O2·-，而羟基自由基可以与DNA发生反应生成8-羟基鸟苷，导致DNA的解旋和氧化损伤，进而抑制细胞的生长（朱融融等，2005）.

虽然纳米材料对微生物和动物细胞毒性及机理方面已有大量研究报道，但对生态系统初级生产力微细藻类的毒性研究方面却报道很少.本研究通过采用有毒化学品对藻类毒性测试的标准实验方法，比较了nano-TiO2和SWCNTs对普通小球藻生长的抑制效应，结果表明在500mg·L-1范围内nano-TiO2对普通小球藻生长的抑制效应不明显（图1），而SWCNTs却可显著抑制普通小球藻的生长，其96h-EC50为261.5mg·L-1（图2），SWCNTs对普通小球藻生长的抑制毒性效应远大于nano-TiO2.进一步通过光学和电子显微镜观察发现，nano-TiO2在水体中基本呈现分散分布且不发生团聚，当与普通小球藻同时存在时，虽然在小球藻细胞周围也吸附少量的nano-TiO2，但仍然没有形成大颗粒的凝聚现象（图3和图4），因此对普通小球藻的光合作用及代谢影响较小.与之相反，SWCNTs在水体中会发生凝聚现象形成较大的颗粒，在与普通小球藻共存时，会吸附大量的小球藻进而形成更大的颗粒（图3和图4），因此阻碍了普通小球藻吸收光和代谢的效率，进而严重抑制了普通小球藻的生长.研究表明，活性氧ROS的生成和氧化应激反应也是碳纳米管细胞毒性的重要方式（Nel et al.,2006;Lam et al.,2006），在SWCNTs对小球藻生长抑制过程中ROS和氧化应激是否起作用值得进一步研究.

大量研究表明，纳米材料的小尺寸效应和其诱导产生的氧化应激反应是其细胞毒性产生的主要原因（Nel et al.,2006），本研究结果显示，在一定环境条件下所形成的颗粒大小及对细胞的吸附作用可能也是影响其细胞毒性效应的原因之一.

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Effects of Nano-TiO2and Single-Walled Carbon Nanotubes on the Growth of Chlorella vulgaris

YANG Xiao-jing2，CHEN Hao1，YAN Hai2，*，QIN Bo2

1.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085
2.Department of Biological Science and Technology,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083

Nanomaterials have been widely used in many fields because of its unique physical and chemical properties.The safety of nanomaterials on organisms is paid increasing attention by people.In this paper,a standard method of algal bioassay for evaluating the toxicity of toxic chemicals was used and the inhibitory effects of nano-TiO2and single-walled carbon nanotubes（SWCNTs）on the growth of Chlorella vulgaris were investigated,respectively.Results showed that the growth of Chlorella vulgaris could not be apparently affected by initial nano-TiO2concentrations from 0.01mg·L-1to 500mg·L-1.However SWCNTs could inhibit the growth of Chlorella vulgaris significantly and its 96h-EC50was calculated as 261.5mg·L-1based on the experimental data.Compared with nano-TiO2,SWCNTs agglomerated and adsorbed a greater amount of the cells of Chlorella vulgaris,which may be responsible for its higher inhibitory effect on the growth of Chlorella vulgaris.

Chlorella vulgaris；nano-TiO2；single-walled carbon nanotubes；toxicity

29 April 2009accepted24 May 2009

1673-5897（2010）1-038-06

X171.5

A

2009-04-29录用日期：2009-05-24

国家自然科学重点基金（No.20537020）；北京科技大学冶金工程研究院基础理论研究基金；北京科技大学多学科交叉项目

杨晓静（1983—），女，硕士研究生；*通讯作者（Corresponding author），E-mail:haiyan@sas.ustb.edu.cn

闫海（1962—），男，博士，教授，博士生导师，北京科技大学应用科学学院生物技术系主任，主要研究方向为微细藻类和微生物的环境生物技术.