细基江蓠繁枝变型在氮及铅胁迫下的响应

杜虹，颜海波，庄东红，陈伟洲

（汕头大学生物系，广东汕头515063）

细基江蓠繁枝变型在氮及铅胁迫下的响应

杜虹，颜海波，庄东红，陈伟洲

（汕头大学生物系，广东汕头515063）

分别研究了细基江蓠在不同浓度氮和铅胁迫下的生理生化响应.结果显示，江蓠日特定生长率、可溶蛋白、藻红素含量随氮浓度增大而增大，均在氮浓度为200μmol/L时达到最大；随着铅浓度升高，江蓠的日特定生长率、可溶蛋白、藻红素、叶绿素a呈下降趋势，SOD、POD、GST的活性则呈现出先上升后下降的趋势.表明江蓠的生长状况与氮浓度具有一定的相关性；江蓠对低浓度铅胁迫具有一定的抵抗能力，受时间和浓度双重因子的制约.

江蓠；氮；铅；胁迫

0 引言

细基江蓠繁枝变型（以下简称江蓠）隶属于红藻门、真红藻纲、杉藻目、江蓠科，用营养枝进行繁殖，具有适应性强、生长快、产量高、栽培方法简单、容易推广、营养储存库大、改善生态环境以及经济价值高等优点.国内外大多数研究主要是针对江蓠属海藻在受氮、磷污染富营养化海域的生物修复方面和对重金属的吸附作用[1-3]，而江蓠属海藻在氮（N）营养盐和重金属铅（Pb）胁迫下的生理生化响应等方面的文献报道较少，而且重金属及营养盐的胁迫是影响江蓠属海藻生长的两大主要因素，这两者对水体的污染几乎是同步的[4].为此，本实验着重研究N营养盐和重金属Pb对江蓠生理生化的影响，以期为江蓠的种植提供指导及为其作为Pb的环境污染监测和毒理诊断提供研究方法.

1 材料和方法

1.1 材料来源及预培养

江蓠（人工养殖）取自广东省汕头市达濠区人工养殖虾池，选择健康藻体，先用天然海水冲洗藻体表面，用镊子除去杂藻，放在室内玻璃缸中预培养一周后挑选粗壮、分枝繁茂整齐、颜色较浓、藻体完整、无损伤腐烂的江蓠进行实验.适应期水温（20±1）℃，光照强度2 000 lx，盐度16‰，光周期12L∶12D，pH为8.0.每天早晚轻微搅动江蓠和海水，使江蓠接受均匀的光照正常生长.

1.2 实验方法

海水为人工配置（P终浓度为4 μmol/L，微量元素用f/2配方）.氮浓度（添加亚硝态N，氨态N，硝态N，摩尔比是1︰10︰4）分别是0、10、50、100、200、400μmol/L.

铅实验：每组培养液（N、P终浓度分别为50、4 μmol/L）分别设Pb浓度为0、0.05、0.5、2.5、5、10 mg/L（以PbCl2形式添加）.

实验选择粗细、长短接近的健康江蓠约3g左右（称量时用滤纸吸干藻体表面水分）于800 mL各组培养液持续培养，周期7天，每个氮和铅浓度培养液设置3个平行，每日观察江蓠的表观症状，隔两日更换一次培养液，培养结束时称重.江蓠日特定生长速率的计算公式：x（%/d）=[（wt/w0）1/t－1]×100%，其中，w0为初始时刻江蓠鲜重（g），wt为t时刻江蓠鲜重（g），t为两次测定间隔时间.培养第3 d、6 d时，测定江蓠藻红素、叶绿素a、可溶性蛋白含量，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽转移酶（GST）活性等指标.可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[5]，藻红素测定参照达维斯[6]方法，叶绿素a测定参考Moran等[7]方法，SOD、POD、GST活性测定分别采用购买的南京建成生物公司试剂盒：A001超氧化物歧化酶（SOD）测试盒，A084-2过氧化物酶（POD）测定试剂盒，A004GSH-ST测试盒（谷胱甘肽-S转移酶测试盒）.

1.3 数据分析

实验重复次数均为3，取平均值并计算标准误差（S）.以下图标中的数据均为平均值±S，图中以垂直短线表示S.

2 实验结果

2.1 氮浓度影响

2.1.1 对日特定生长率的影响

从图1可以看出，当N浓度为200 μmol/L时，江蓠的日特定生长率最高，为3.98%，其次是100 μmol/L，为2.75%；与低N实验组（50、10 μmol/L）相比差异显著（P＜0.05）；当N浓度增加至400 μmol/L时，其日特定生长率较200 μmol/L

时有所下降.可见江蓠日特定生长速率随着N浓度的增加而增加，其原因可能是营养盐浓度的上升可使藻体一系列生理过程的底物浓度升高，但高浓度N会抑制江蓠的生长.

2.1.2 对可溶性蛋白、藻红素、叶绿素a的影响

图1 氮浓度对日特定生长率的影响

氮浓度对江蓠可溶性蛋白、藻红素、叶绿素a的影响w1、y1、z1见图2.由图2可以看出，当N浓度小于200 μmol/L时，江蓠的可溶性蛋白、藻红素的含量均随着N浓度的增加而增大，在200 μmol/L时达到最大，分别是6.23%和0.282 mg/g；当N浓度进一步升高，达到400 μmol/L时，可溶性蛋白和藻红素含量呈下降趋势.但叶绿素a的含量与N浓度的关系不是很明显.这些指标在第3天和第6天没有明显的区别，提示了N对江蓠生理生化的影响从第3天（或更早）已经发挥了作用.

2.2 铅浓度影响

2.2.1 对日特定生长率的影响

从图3可以看出，随着Pb浓度的增加，江蓠日特定生长率呈下降趋势，在Pb为10 mg/L时最低，为1.68%，而最高则是当Pb浓度0.05 mg/L时，为2.93%.方差分析知，高浓度Pb实验组(5、10 mg/L)江蓠日特定生长率与低浓度Pb实验组相比(0.05、0.5 mg/L)差异显著（P＜0.05）.

2.2.2 对可溶性蛋白、藻红素、叶绿素a的影响

铅浓度对江蓠可溶性蛋白、藻红素、叶绿素a的影响w2、y2、z2见图4.由图4可以看出，江蓠可溶性蛋白、藻红素和叶绿素a的含量都随着Pb浓度的增大而呈下降趋势，在处理浓度为0.05、0.5和2.5 mg/L时，与对照组相比均没有显著性变化；而当Pb浓度进一步升高且处理时间延长时，这些指标与对照组相比出现显著性下降（P＜0.05）.

2.2.3 对SOD、POD、GST活性的影响

图2 氮浓度对可溶性蛋白、藻红素、叶绿素a的影响

图3 铅浓度对日特定生长率的影响

图4 铅浓度对可溶性蛋白、藻红素、叶绿素a的影响

由图5所示，Pb对江蓠SOD、POD、GST活性的影响P1、P2、P3均随其浓度的增加呈现出先升后降的趋势.SOD活性峰值（248.6 U/mg）出现在Pb为2.5 mg/L，高出对照组19.2%；POD和GST的活性峰值分别为247.12和79.6 U/mg，均出现在Pb为5 mg/L，并分别高于对照组60.1%和43.0%.但当再增加Pb处理浓度时，江蓠SOD、POD、GST活性则出现明显的下降趋势，且均低于对照组.由图5还可以看出，Pb对江蓠SOD、GST活性的影响主要与其浓度有关，与处理时间关系不明显，而Pb对POD活性的影响则与处理浓度和时间均相关.

3 讨论

图5 铅浓度对SOD、POD、GST活性的影响

氮是海藻生长过程中非常重要的一种营养元素，一般情况下海藻生长率的变化与外界N供应

的变化相一致[8]，外界营养供应影响海藻体内的化学组成、发育、形态、繁殖及分布[9].本实验结果表明，在其它环境因子如温度、盐度、光照、pH值等固定时，江蓠的日特定生长率随着N浓度的增加而增加，其原因可能是江蓠体内藻红素含量的提高促进江蓠的光合作用（藻红素是红藻光合作用过程中将光能转变为化学能的关键色素）.但当N浓度升高到400 μmol/L时，藻红素在藻体内的含量降低，进而抑制江蓠的生长[10].表明藻红素与介质中N浓度具有一定的相关性，并且这种相关性必须要求N浓度在一定的范围内，即不超过200 μmol/L.

在不同的N水平下，江蓠藻体内的叶绿素a含量变化不大，暗示着藻体内叶绿素a含量与环境中的N浓度关系（N缺乏时间不长时）不密切，而是与环境因子中的光照、温度等相关，如高光照和低温可促进海藻叶绿素的生成[11-13].

有研究表明N浓度的高低会引起藻体色泽的变化[9，14-15]，本研究显示当N浓度超过200 μmol/L时，可能超过了江蓠藻体N储藏库的最大允许容量，进入藻体的N不能参与蛋白的合成和生长，而且无机氮（NO2-，NH4+）浓度过高对江蓠有毒害作用，导致江蓠不能正常生长，藻体内的可溶蛋白含量呈下降趋势，藻体也因此由褐色逐渐转变成黄色、白色.说明了江蓠对N的吸收可能存在一个临界饱和点，超过这个点，将会对江蓠的生长起抑制作用.

重金属是严重的环境污染物，对植物和动物都具有高毒性.在所有的重金属当中，铅是一种剧毒金属物质，是人体非必须元素，对很多组织都有毒性，随着采矿、冶炼以及Pb处理等工业的发展，Pb污染问题日益严重，而且遍及人类的整个活动范围.本实验中Pb污染引起江蓠藻红素、叶绿素a和可溶性蛋白含量减小，并且随其胁迫时间的推移，下降越显著，说明铅在藻体内逐渐积累，对江蓠的伤害逐渐显现，各项指标值不断下降.藻红素作为天线色素参与光合作用，容易受到环境因素的影响[16]，本实验结果也证实，各培养组藻红素的含量均随着铅浓度增加而下降.可溶蛋白和叶绿素a含量的下降可能是由于重金属离子与—SH基结合导致蛋白变性，也可能是由于重金属取代了酶蛋白的活性中心，致使其失活，从而阻碍了叶绿素等的合成，或取代其中的Fe2+、Zn2+等，直接破坏叶绿体的结构，或DNA翻译转录途径受阻，影响了蛋白质的合成，进而影响江蓠可溶蛋白的含量.

SOD和POD协同作用可以降低氧自由基等对江蓠细胞膜结构潜在伤害的可能性，GST是提供细胞还原力的一个主要的酶.在低浓度Pb胁迫处理时，江蓠体内的SOD、POD、GST活性升高，但高浓度Pb存在时，这3个酶的活性下降.表明江蓠对Pb有一定的抗性，但存在一定的阈值，当超过这一阈值时，可能致使细胞内长时间地维持在较高的O2-，细胞内的活性物质包括酶会受到损伤，导致其活性下降.因此，江蓠对重金属Pb在一定浓度范围内（0~5 mg/L）具有一定的耐受能力，反映在外观表征变化不是很明显，各项生理生化指标变化不是很剧烈，体内酶活力有一定的上升趋势；当铅浓度超过了5 mg/L时，毒性逐渐显示出来，无论是表观症状还是生理生化指标均与对照组有很明显的变化，体内的酶活力也急剧下降.

本实验研究了N营养盐和重金属Pb对江蓠生理生化的影响，为江蓠的种植提供了一定的指导及为Pb的环境污染监测和毒理诊断提供了研究方法.

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Gracilaria Tenuistipitata in Response to Nutrients and Heavy Metal Pb Stress

DU Hong,YAN Hai-bo,ZHUANG Dong-hong,CHEN Wei-zhou
(Department of Biology，Shantou University，Shantou 515063，Guangdong，China)

In different concentration of inorganic nitrogen and heavy metal Pb，the physiological and biochemical responses of Gracilaria tenuistipitata are investigated.The resultshows thatthegrowthrate，thecontentofsolubleprotein,thecontentof phycoerythrininGracilariatenuistipitatawiththeincreaseoftheconcentrationof inorganic nitrogen reaches maximum when the concentration of inorganic nitrogen is 200 μmol/L.As the Pb concentration increases，the growth rate,the content of phycoerythrin,the content of Chlorophyll a and soluble protein all decrease.The activity of SOD，POD，GST increases at first，and then shows a downward trend.Studies have shown thatGracilariatenuistipitata’sgrowthconditionrelevantwiththeconcentrationof inorganic nitrogen and Gracilaria tenuistipitata has certain ability to resist the Pb stress on the low concentration.The poison effects of Pb on Gracilaria tenuistipitata are constrained by time and the concentration of dual-factor.

Gracilaria tenuistipitata；nitrogen；Pb；stress

Q 89

A

1001-4217（2010）01-0029-06

2009-09-23

杜虹（1976-），女，广东汕头人，博士，副教授.研究方向：近岸水域生态学和海洋环境保护研究.E-mail：hdu@stu.edu.cn

广东省科技计划重点项目资助（2006A36502001；2007A032600003）